survivin、VEGF及Ki67在结直肠癌中的表达及其临床意义
【摘要】 目的 探讨结直肠癌组织中存活素（survivin）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、细胞核增殖相关抗原Ki67的表达与各临床病理因素的关系，评价survivin、VEGF及 Ki67在结直肠癌预后判断中的价值。 方法 采用免疫组织化学PowerVision两步法检测40例结直肠癌组织中survivin、VEGF及 Ki67的表达情况，回顾性分析survivin、VEGF及 Ki67与各临床病理因素及预后之间的关系。结果 survivin、VEGF及 Ki67在结直肠癌组织中的表达阳性率均明显高于癌旁正常组织(P<0.01)，与Duke's分期及淋巴结转移有明显相关(P<0.05),Duke's C期、D期结直肠癌组织明显高于Duke's A期、B期，有淋巴结转移组survivin、VEGF及 Ki67阳性率明显高于无淋巴结转移组。survivin、VEGF及 Ki67阳性表达患者3、5年生存率明显低于表达阴性者(P<0.05)。结论 在结直肠癌发生、过程中伴随着survivin、VEGF及Ki67的表达，检测结直肠癌组织survivin、 VEGF及Ki67可能对判断结直肠癌的淋巴结转移及病情进展有一定的价值。survivin、VEGF及 Ki67阳性的患者3年、5年生存率明显降低，对三者进行检测，可以对结直肠癌患者的预后评估有一定的辅助意义。
【关键词】 survivin；VEGF；Ki67；结直肠癌；免疫组织化学
Expression and Clinical Significance of survivin、VEGF and Ki67 in Colorectal Carcinoma
Abstract：Objective To investigate the relationship between the expression of survivin、VEGF 、Ki67 and the clinicopathologic parameters in colorectal carcinoma(CRC),and evaluate their significances in predicating the prognosis.Methods Immunohistochemical method by two?step Power Vision was used to detect survivin、VEGF 、Ki67 expression in 40 patients with CRC.The relationship between the expression of survivin、VEGF 、Ki67 and the clinicopathologic parameters,prognosis was retrospectively analyzed.Results The positive rates of survivin、VEGF 、Ki67 in CRC were all higher than those in matched normal tissues(P<0.01).Their expressions were related to Duke's stages and the metastasis of lymph nodes.The expression rates of the three markers in CRC with the metastasis of lymph nodes were higher than those without metastasis(P<0.05),and higher in Duke's C、D stages than in Duke's A、B stages(P<0.05).survival rate of 3 years and 5 years were lower in those patients with the positive expression of these markers than in those with the negative expression(P<0.05).Conclusion The expression of survivin、VEGF 、Ki67 were associated with the development and metastasis of CRC.The patients with expressions of survivin、VEGF 、Ki67 have lower survival rates of 3 years and 5 years.We may evaluate the prognosis of CRC through the test of survivin、VEGF and Ki67.
Key words：survivin；VEGF；Ki67；Colorectal Carcinoma(CRC); Immunohistochemistry
0引言
恶性肿瘤的形成及发展与肿瘤的凋亡抑制、血管形成及肿瘤细胞的克隆性增殖有关。survivin是凋亡抑制因子IAPs家族（Inhibitors of apoptosis）的新成员，抑制细胞在bcl?2的下游阻断了半胱氨酸蛋白酶Caspase?3和Caspase?7凋亡调节通路[1]，在正常组织中不表达，而选择性的表达于恶性肿瘤组织。在诱导肿瘤血管形成的因子中，血管内皮生长因子（VEGF）被认为是最重要的血管形成因子[2]。能反映肿瘤细胞增殖活性的指标很多，目前以Ki67最具有代表性[3]。
本实验主要是研究这三个指标在结直肠癌组织中的表达及与各临床病理因素以及3、5年生存率之间的关系，为今后临床预后的判断提供实验依据。
1 资料和方法
1.1一般资料
收集江苏省肿瘤外科1999～2000年间结直肠癌手术切除标本40例，男25例，女15例，年龄24～79岁，平均年龄56岁，其中结肠癌20例，直肠癌20例。所有标本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，光镜观察。病理类型：管状腺癌23例，乳头状腺癌12例，粘液腺癌5例。Duke's分期：A期2例，B期17例，C期12例，D期9例。术前均无放疗、化疗史。术后经1～60个月随访，因病情恶化而死亡25例，死亡率65.0%。
1.2试剂与方法
survivin鼠抗人单克隆抗体（工作浓度1：50）、VEGF兔抗人多克隆抗体（工作浓度1∶50）、Ki67兔抗人多克隆抗体（工作浓度1∶50），通用型免疫组化染色试剂盒PV试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用免疫组织化学PowerVision两步法，参照试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性表达的胃癌标本作为阳性对照。
1.3阳性判定标准
以棕黄色颗粒定位于胞浆包括游离缘的肿瘤细胞为survivin、VEGF阳性细胞，以棕黄色颗粒定位于细胞核的肿瘤细胞为Ki67阳性细胞。随机选择10个有代表性视野，阳性细胞占镜下细胞的百分比。阳性染色细胞＞10%为阳性表达。
1.4统计学分析
survivin、VEGF、 Ki67表达状态与结直肠癌临床病理特征之间的关系、单因素生存率比较采用Pearson卡方检验。所有统计学处理均采用SPSS10.0统计软件包进行。
2结果
2.1免疫组化染色结果
survivin、VEGF阳性染色定位于胞浆中包括游离缘。40例中有24例survivin表达阳性，阳性率为60%，有29例VEGF表达阳性，阳性率为72.5%，10例癌旁正常组织均无survivin、VEGF的表达。Ki67阳性染色定位于细胞核，40例中有32例Ki67表达阳性，阳性率为80%，10例癌旁正常组织中有2例Ki67表达阳性。survivin、VEGF、Ki67阳性表达范围10%～80%,见图1～3。
2.2survivin、VEGF及 Ki67的表达与结直肠癌临床病理特征的关系
三者的表达与患者的性别、年龄、肿瘤的部位、大小、病理类型无明显关系（P＞0.05），与Duke's分期及有无淋巴结转移明显相关(P<0.05)，见表1。表1 survivin、VEGF、Ki67的表达与结直肠癌临床病理特征的关系（略）
2.3预后因素分析
40例结直肠癌患者随访结果：3年存活24例，3年存活率60％，5年存活14例，5年存活率35％。survivin、VEGF及Ki67的表达状态与3、5年生存率显著相关(P均<0.05)，见表2。 表2 survivin、VEGF、Ki67的表达与3、5年生存率之间的关系（略）
3讨论
结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发生和机制尚未完全阐明。目前研究发现，肿瘤的凋亡抑制、血管形成及肿瘤细胞的克隆性增殖在结直肠癌的发生和发展中可能有重要的地位。
survivin是凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族的新成员。survivin可能主要通过两条途径来抑制细胞凋亡：其一是通过直接抑制凋亡终末效应器Caspase?3和Caspase?7的活性阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程；其二是survivin与周期蛋白激酶Cdk4[4]、p34cdc2[5]相互作用阻断凋亡信号传导通路。国外研究表明，survivin具有凋亡抑制、血管保护、调节细胞周期等多种生物学活性，与结直肠癌的恶性程度及预后密切相关[6]。本组实验结果显示：40例结直肠癌组织中有24例（60%）survivin阳性表达，10例癌旁正常组织均无survivin的表达，与Kawasaki等[6]对171例大肠癌和癌旁正常组织的研究结果基本一致。这种在正常组织中不表达，而在肿瘤组织中表达特点提示survivin基因在结直肠癌发生阶段被激活，表达出大量survivin蛋白，可作为结直肠癌发生阶段的分子标志物。本组研究资料显示survivin在结直肠癌中的表达与结直肠癌的Duke's分期及淋巴结转移呈正相关(P<0.05)，尤其与Duke's分期显著相关（P<0.001），说明survivin阳性表达在结直肠癌发展、转移过程中起着重要作用。分析survivin与患者3、5年生存率的关系发现：survivin阳性组与阴性组之间生存率存在显著差异(P<0.05)，survivin阳性组患者术后3、5年生存率显著低与阴性组。提示survivin阳性表达可能是预后不良的指针。
血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）VEGF是1989年Ferrara等从牛正常垂体滤泡星行细胞中分离纯化出来的一种特异性蛋白质。其主要作用在于参与血管内皮细胞增殖、血管形成及肿瘤的浸润、转移[8]。本组研究结果显示，结直肠癌VEGF表达与Duke's分期及淋巴结转移相关，与其他各项临床指标无相关性，与Han等[8]报道一致，提示VEGF可作为判定病情进展的标志之一。VEGF阳性的结直肠癌患者3、5年生存率显著低于阴性者(P<0.05)，说明随着侵袭力和转移程度的增加，患者生存时间明显缩短。
Ki67是应用最广泛的增殖细胞标志之一，参与肿瘤的发生、发展[9]。本研究分析Ki67与结直肠癌的关系发现，在结直肠癌中Ki67的阳性表达率明显高于癌旁正常组织(P<0.05)，与结直肠癌的临床分期及淋巴结转移呈正相关，与患者术后生存时间呈负相关(P<0.05)。说明从正常粘膜到大肠癌，其细胞增殖活性增强，大肠癌细胞增殖活性越高，浸润转移的可能性越大，Ki67可作为判断预后的指标。
综上所述，结直肠癌中survivin、VEGF及Ki67基因表达上调，其表达与结直肠癌的发生、发展密切相关，对三者进行检测，可以对结直肠癌患者的预后评估有一定的辅助意义。
【参考】
［1］Yang J, Liu FX, Yan XC. Research advances on inhibitor of apoptosis, survivin［J］. Ai Zheng, 2003, 22(7):771?774．
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［3］Ben?Izhak O, Bar-Chana M, Sussman L, et al. Ki67 antigen and PCNA proliferation markers predict survival in anorectal malignant melanoma［J］. Histopathology, 2002, 41(6):519?525．
［4］Suzuki A, Hayashida M, Ito T, et al. Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16(INK4a) and Cdk2/cyclin E complex activation［J］. Oncogene, 2000, 19(29):3225?3234．
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［6］Kawasaki H, Toyoda M, Shiohara H, et al. Expression of Survivin correlates with apoptosis, proliferation, and angiogenesis during human colorectal tumorigenesis［J］. Cancer,2001,91(11):2026?2032．
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［8］Han J, Xia C, Gao J, et al. Expression of vascular endothelial growth factor in colorectal cancer and its clinical significance［J］. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2002, 82(7):481?483．
［9］Iolota V, Batistatou A, Tsamandas AC, et al. Immunohistochemiocal expression of TGF?betal, p21WAF1, p53, Ki67, and angiogenesis in gastric carcinomas: a clinicopathologic study［J］. Int J Gastrointest Cancer，2002，32(2?3):83?89.
