鼻咽癌遗传学研究进展
【摘要】 鼻咽癌是我国南方最常见的恶性肿瘤之一，具有明显的家族聚集性和国外南方移民后裔中较高的发病率，存在基因组不稳定的特点，易受理化、生物性等致癌因素的攻击，是一种遗传和环境因素共同作用的多基因遗传性肿瘤。全文主要针对鼻咽癌基因组不稳定性、表观遗传学改变、遗传易感性（区）和易感基因克隆等方面取得的相关进展进行综述。
【关键词】 鼻咽肿瘤 遗传学 基因组不稳定性 表观遗传学 易感基因
鼻咽癌是中国特色癌，被西方学者俗称“中国癌”（Chinese Cancer），在我国南方（广东、广西、福建和湖南等）是最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的身心健康。鼻咽癌的病因除了广为人知的理化因素（如化学致癌物等）和生物因素（如EB病毒感染等）外，机体自身的遗传易感性在鼻咽癌的发病过程中发挥了非常重要的作用。大量的流行病学调查结果表明，鼻咽癌具有明显的家族聚集性和国外中国南方移民后裔中较高的发病率。早在20世纪80年代，我们就已证实鼻咽癌患者存在基因组不稳定的特点，有遗传脆弱性，易受理化、生物性等致癌因素的攻击[1]。这都说明鼻咽癌发病具有重要的遗传基础和遗传易感性。本研究主要针对鼻咽癌的基因组不稳定性、表观遗传学改变、遗传易感性和易感基因克隆等方面取得的相关进展进行综述。
1 鼻咽癌基因组不稳定性
1.1 染色体不稳定性
鼻咽癌的染色体核型多为非整倍体，其染色体畸变以易位、缺失和重复多见，常出现恒定的非随机染色体畸变。夏家辉等[2，3]首先在鼻咽癌类淋巴母细胞中发现1号和3号染色体相互易位所导致的巨大亚着丝粒染色体。随后，邓龙文等[4，5]也发现3q+的亚着丝粒染色体及7q+，断裂点在7q32或7q23。Lo KW等[6]发现数目和结构异常的染色体主要出现在1、3p、3q、5q、9p、11q、12、13q、14q和X染色体，并同时检测到了高频率3p的缺失和3q的增加，其断裂点最常发生在1p11~31、3p12~21、3q25、5q31、11q13、12q13和Xq25。Wong N等[7]在鼻咽癌细胞系中进一步证实了上述染色体的异常改变，同时发现了一些新的染色体断裂点3p21、3q26、5q31、6p21~25、7p14~22和8q22。
姊妹染色单体交换(SCE)是DNA复制产物在两条染色单体之间的同源位点上的交换，与DNA链断裂和重组有关[8]，因此其交换频率是反映染色体脆性的一个良好指标。早期研究结果表明，鼻咽癌患者的SCE频率显著高于健康人，同时发现由遗传因素引起的鼻咽癌基因组不稳定性能显著增强鼻咽癌患者对环境中EBV和化学致癌物，特别是亚硝胺类化合物的易感性，从而导致SCE频率的增加[9]。
比较基因组杂交(CGH)是Kallioniemi等[10]1992 年创建的一种新的分子细胞遗传学方法,可在全部染色体或染色体亚区水平对肿瘤细胞的DNA拷贝数进行检测并定位。迄今至少有六个课题组通过CGH技术对鼻咽癌全基因组/23对染色体进行了分析[11~16]。通过对这些课题组获得结果的综合分析，发现鼻咽癌染色体高频扩增的区域主要集中在1q、2q、3q、8q、12p和12q；染色体高频缺失的区域主要发生在3p、9p、11q、13q，14q和16q。我们课题组得到的DNA高频扩增区主要位于1q、2p、2q、3q、7q、8q、12p和12q（其频率均大于30%），最小共同扩增区在3p14.3-ter, 11q23~24, 16q和9p22-ter；DNA高频缺失区主要位于3p、9p、11q和16q（其频率均大于或等于30%），最小共同缺失区位于1q25~31、3q24~25、7q31、8q13-ter、12q15~21[16]。不容忽视的是，不同课题组报告的实验结果存在一定程度的差异，特别是DNA拷贝数发生改变的频率，究其原因：①标本的来源；②样本的大小；③临床病理类型；④癌细胞的纯度等。这些因素很可能在一定程度上导致了结果的偏差。鼻咽癌DNA高频扩增区和缺失区的定位，为鼻咽癌瘤基因和抑瘤基因的定位候选克隆奠定了基础。
1.2 鼻咽癌等位基因不平衡
全基因组扫描技术建立在杂合性丢失研究技术基础之上，是采用覆盖全基因组的微卫星DNA多态引物对全基因组进行扩增，并采用基因扫描和分型软件各个微卫星位点上等位基因的大小和频率，是一种检测基因组等位基因杂合性缺失最常见的方法。先后有五个课题组采用全基因组扫描技术研究了鼻咽癌的全基因组等位基因型[17~21]。由于样本大小不一、微卫星标记选择的不同或有些鼻咽癌组织样本没有经过显微切割（标本不纯）等原因，导致不同课题组得出的结果存在一定程度上的差异，或者得出的缺失频率偏低。但通过整合分析，鼻咽癌高频率等位基因杂合性丢失区主要集中在染色体臂3p,9p,11q,13q,14q和16q。这些课题组结果相互验证，且与CGH研究的结果基本一致，进一步提示这些区域内可能存在鼻咽癌抑瘤基因。同时，我们课题组先后对鼻咽癌患者进行微卫星杂合性丢失研究，精细定位了鼻咽癌在染色体3p、7q和9p上的三个最小共同缺失区D3S1560~D3S1620、D7S509、D9S161~D9S1853[22~25]。
2 鼻咽癌表观遗传学
表观遗传学是基于一种可遗传的非基因序列改变而导致基因表达水平和功能的变化，包括DNA甲基化和染色质构象变化等，其中染色质构象变化主要由染色质组蛋白的修饰作用(乙酰化、磷酸化等)引起。因此，表观遗传学是生命中一个普遍而又十分重要的新的研究领域，不仅对基因表达、调控、遗传有重要作用，而且在肿瘤、免疫等许多疾病的发生和防治中亦具有十分重要的意义。
2．1 鼻咽癌基因组的甲基化改变
DNA甲基化是恶性肿瘤最常见的分子改变之一，包括基因组总体甲基化水平降低和某些基因启动区域发生高甲基化。低甲基化通常发生在中度和高度重复序列，包括异染色质DNA重复序列、散布的逆转录转座子、内源性逆转录病毒元件以及部分单一序列（如癌基因等）。通常情况下，癌细胞整体处于低甲基化，但部分管家基因和抑瘤基因启动子的CpG岛区处于高度甲基化。近年来，启动子区域CpG岛高甲基化被认为是恶性肿瘤中抑瘤基因表达沉默的一个主要机制[26，27]。Joseph Kwong 等[28]同时对鼻咽癌中多个基因进行了甲基化检测，发现这些基因在鼻咽癌中发生甲基化的频率分别为：RASSF1A（84%），RARβ2（80%），DAP-kinase（76%），p16（46%），p15（17%），p14（20%），MGMT（20%），GSTP1（3%）；而在鼻咽正常组织中没有检测到这些基因的甲基化改变。由此可见在鼻咽癌基因组中可同时存在多个抑瘤基因5′端CpG岛的高度甲基化。在EB病毒感染的恶性肿瘤中更容易检测到全基因组中CpG岛的高度甲基化，且在头颈部肿瘤中以鼻咽癌发生频率最高[29]。因此，EB病毒感染更有利于癌细胞基因组中高甲基化的发生。事实上，早前大量证据表明，在EB病毒相关的恶性肿瘤基因组中能够检测到EBNA和LMP中5′端CpG岛的高度甲基化[30，31]，这种甲基化不同于一般的沉默抑瘤基因的表达，而是可能在维持EB病毒对NPC的潜伏感染状态发挥重要作用[32]。不仅如此，EB病毒的LMP在NPC中可通过活化DNA甲基转移酶而增加E-cadherin启动子CpG区的甲基化水平，从而下调其表达水平[33]。近年来，越来越多的基因在鼻咽癌基因组中检测到了5′端CpG的高甲基化，如RIZ1[34]，TSLC1[35]，TIG1[36]，CHFR[37]，THY1[38]，WIF-1[39]等，这些基因启动子区域的高甲基化影响基因转录活性，导致其表达水平的下调，从而影响其参与的信号转导通路。由此可见，在鼻咽癌基因组中出现了大量抑瘤基因的启动子区域的高甲基化，但暂无资料显示其它区域的低甲基化水平。
2．2 鼻咽癌组蛋白的修饰作用
导致基因失活的表观遗传机制除了主要包括DNA 甲基化外，还包括组蛋白乙酰化和染色质高级结构中其他成分的修饰, 这些修饰影响染色质构型, 导致基因转录调控失常, 从而致癌。研究表明核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化与基因调控密切相关,负责组蛋白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的蛋白酶—组蛋白乙酰化转移酶(HAT) 和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)。HAT能够乙酰化组蛋白氨基末端，舒展核小体结构，激活基因转录；而HDAC 的功能相反,抑制基因转录。特定基因的表达状态取决于被转录因子定位于靶基因启动子上的HAT 和HDAC 间的动态平衡。Bromodomain作为一种重要的信号分子结构域，可特异性地与组蛋白末端乙酰化的赖氨酸位点结合，将核内组蛋白乙酰化信号传递给转录相关的蛋白质复合物，通过改变染色质的构象并协调多个转录复合物与染色质模板的有序结合，从而共同参与信号依赖性的、非基础性的基因转录调控[40，41]。
BRD7是我室自主克隆的一个鼻咽癌抑瘤基因，属bromodomain蛋白家族的一个成员，能够与乙酰化组蛋白H3结合，影响基因的转录调节功能。在乙酰化酶抑制剂TSA作用下，降低了组蛋白H3的乙酰化水平及与BRD7的结合能力。说明组蛋白的乙酰化水平影响BRD7在鼻咽癌中转录调节功能和细胞生物学功能的发挥[42]。Sp1/ KLFs是参与真核细胞转录的高度相关锌指蛋白，与共抑制/激活因子相互作用参与基因的转录调节。研究表明组蛋白乙酰化和去乙酰化可能是Sp1/KLFs 蛋白，是激活/抑制因子的功能转换开关。组蛋白去乙酰化酶特异性抑制因子HDAC1的过度表达通过TSA可明显抑制KLF4启动子的转录活性[43]。由此可见组蛋白的乙酰化状态与基因的表达水平和转录活性密切关联。
3 鼻咽癌遗传易感性与易感基因
3.1 鼻咽癌遗传易感区（性）
毋庸置疑,遗传因素在家族性鼻咽癌的发病过程中发挥了非常重要的作用。近年来先后有多个课题组通过基于家系的遗传连锁分析和关联分析，先后报道了鼻咽癌在不同的染色体上存在的遗传易感区。
染色体4p：Feng BJ等[44]通过基于家系的全基因组扫描和连锁分析，将广东鼻咽癌的遗传易感区定位于染色体上遗传距离为14.21cm的4p15.1~q12区域。陈汉奎等[45]在上述基础上，通过对两个主要的NPC家系采用微卫星标记和单核苷酸多态性标记进行单体型分析，进而将广东NPC易感区域的远端边界确定于D4S1577和D4S3347之间, 并将该区域缩小到遗传距离长度为8.29cm的4p11~p14区域。
染色体3p：我们课题组对鼻咽癌染色体高频缺失区3p、9p以及广东家族性鼻咽癌的遗传易感区4p15.1~q12在18个湖南鼻咽癌家系中进行了遗传连锁分析，发现染色体3p21区与鼻咽癌紧密连锁（LOD值为4.18），并将湖南家族性鼻咽癌的遗传易感区锁定在遗传距离为13.6cm的3p21.31~21.2区域[46，47]。
HLA区：早期研究发现人类白细胞抗原(HLA)的类型与鼻咽癌发病存在密切关联，其关联次序依次为A2、BW46、B17/BW58、DR3及DR9。如果HLA-A2型的人长期暴露在化学致癌物下，其患鼻咽癌的风险性显著加大[48]。Lu CC等[49]近年来发现鼻咽癌患者中HLA-A2亚型所占的比重明显高于正常对照组。同时发现单纯的B46和B38亚型不能增加患鼻咽癌的风险，但一旦与A2亚型同时出现，则患鼻咽癌的风险显著增加。通过对定位在HLA-A末端97kb处的一个微卫星标记D6S211与鼻咽癌的相关性进行研究，发现4号等位基因与鼻咽癌紧密关联，支持台湾鼻咽癌的遗传易感基因定位在HLA-A位点。通过进一步对HLA-A位点附近的8个多态性位点与鼻咽癌的相关性进行研究，从而将鼻咽癌的遗传易感区精细定位在D6S510和D6S211位点之间132kb的范围内[50]。
在遗传易感性研究方面，我们课题组通过SSCP分析和直接测序方法发现BRD7中C450T和A737C两个偶联的多态性改变与散在鼻咽癌患者和鼻咽癌家系患者存在关联或遗传连锁[51]；通过动态等位基因杂交（DASH）技术发现NGX6的上游调控区的一个SNP rs879284与鼻咽癌发病存在显著相关性[52]；通过大规模测序方法对NOR1基因编码区的cSNP进行了基因分型，发现NOR1的两个cSNP (ss2220003和ss3211583)之间存在连锁不平衡，且均与鼻咽癌发病密切相关[53]；通过测序方法在对UBAP1进行SNP分型的过程中，发现该基因第6外显子中的一个SNP（rs1049557）与鼻咽癌的发生显著相关[54]。同时其他课题组亦报道HSP70-2的p2/p2纯合基因型[55]、Cyclin D1的A870G的SNP改变[56]以及p53第73外显子Pro/Arg的多态性改变[57]均与散在性鼻咽癌发病存在显著关联。
3.2 鼻咽癌遗传易感基因
鼻咽癌是多基因遗传性疾病已成为大家的共识。长期以来，鼻咽癌领域研究者也一直在试图分离克隆或在大量的已知抑瘤基因中筛选、鉴定鼻咽癌遗传易感基因，但是迄今尚无确切的鼻咽癌遗传易感基因的报道。我们课题组在鼻咽癌候选抑瘤基因的分离克隆和功能研究方面做了较系统的研究工作，先后通过EST介导的定位候选克隆、cDNA代表性差异分析、抑制性消减杂交和生物信息学的克隆等策略分离克隆了20个鼻咽癌候选抑瘤基因（表1），并对这些基因在鼻咽癌中的表达、细胞生物学功能及其参与细胞周期、细胞凋亡、侵袭与转移分子机制进行了比较系统、深入的研究，证实BRD7、NGX6、SPLUNC1、NOR1和NAG7为鼻咽癌抑瘤基因，结合遗传易感性分析的结果，初步确定BRD7、NGX6、SPLUNC1为鼻咽癌候选易感基因。
BRD7：BRD7是我们课题组通过cDNA代表性差异分析和文库筛选等方法自主克隆的一个鼻咽癌相关全长新基因[58]。该基因在鼻咽癌组织或细胞系中表达下调或缺失，通过参与Ras/MEK/ERK和Rb/E2F两条通路阻止细胞周期进程，抑制鼻咽癌细胞生长和恶性生物学行为[59，60]。同时发现BRD7编码蛋白能够与乙酰化组蛋白H3结合，具有bromodomain结构域依赖性，是一个bromodomain蛋白家族新成员[42]；含有一个功能性的核定位信号序列，能够与核转录因子BRD2、IRF2等发生交互作用[61~63]，下调E2F3启动子的活性[60]，是一个潜在的核转录调节因子。通过对BRD7基因编码区进行单核苷酸多态性（cSNP）分析，在其编码区发现了3个cSNP（C450T、A538C和A737G），其中C450T与A737C多态性偶联改变发生在87.7%的鼻咽癌活检组织和配对的外周血、所有鼻咽癌家系的患者及8个易感成员，而仅存在于22%的正常人外周血标本中。说明C450T和A737C偶联的多态性改变是鼻咽癌发生和发展的重要遗传易感风险因子（P<0.01）[51]。
SPLUNC1：SPLUNC1(NASG)主要表达在鼻咽上皮和气管组织，是一个在鼻咽癌中低表达或表达缺失的鼻咽上皮组织相对特异性基因。在鼻咽癌发生的早期（轻度不典型增生）就已明显表达下调[64]。SPLUNC1蛋白为分泌性蛋白，覆盖在鼻咽上皮表面，在上皮组织与外界环境中的有害物质之间形成一层液体的免疫屏障，并具有抵抗微生物入侵（如EBV和纳米细菌）和结合细菌脂多糖的作用，从而确定了SPLUNC1是鼻咽部的一种固有免疫保护分子，可能在鼻咽癌发生的极早期阶段起固有免疫保护作用[65]。
NGX6：NGX6是通过定位候选克隆和文库筛选等方法从鼻咽癌的高频杂合性缺失区9p21~22分离克隆的全长新基因。该基因在鼻咽癌组织和细胞系中表达下调，能抑制鼻咽癌细胞增殖与肿瘤形成，抑制肿瘤的侵袭与转移，与鼻咽癌的淋巴结转移呈负相关。同时发现它能与细胞外黏附分子ezrin能发生交互作用，可能通过与ezrin的交互作用及对EGF/Ras/MAPK通路的负性调节作用而抑制鼻咽癌细胞的恶性增殖和侵袭转移[66，67]。通过大规模测序、动态等位基因特异性杂交(DASH)等技术，在大量鼻咽癌和正常对照组人群中对该基因进行了进一步单核苷酸多态(SNP)分型，在NGX6的上游调控区发现了一个新的SNP位点SNP (rs879284)，是鼻咽癌发生和发展的重要遗传易感风险因子[52]。
鼻咽癌是一种复杂的遗传性肿瘤，其遗传易感基因的克隆与鉴定是一项长期而艰巨的工作。虽然目前尚无明确遗传易感基因的报道，但随着鼻咽癌遗传易感区域的精细定位及系列鼻咽癌抑瘤基因的克隆和鉴定，可以乐观地预期鼻咽癌遗传易感基因的克隆和鉴定已为期不远。
4 鼻咽癌多击多步发病模式
鼻咽癌的发病存在多个遗传易感基因的参与，这些易感基因分别作用于鼻咽癌发病的不同环节或阶段，若干个功能相似或互补的易感基因组成一个易感基因群，共同决定鼻咽癌的发病阶段或表型。SPLUNC1、LPLUNC1和NOR1等很可能作用于鼻咽癌发病的极早期，在鼻咽上皮的固有免疫保护或抵抗外来化学致癌物入侵过程中发挥重要作用，其表达的缺失或失活导致正常鼻咽上皮向异常增生上皮转化；BRD7、UBAP1和NAG7等很可能作用于鼻咽癌发病的某一个中间环节，导致鼻咽癌细胞的进一步恶性转化；NGX6、LTF、nm23和ezrin等很可能与鼻咽癌细胞的恶性表型和肿瘤的侵袭转移密切相关。这些基因的单独失活不足以引起鼻咽癌的发生，其表达或功能的恢复亦只能有限逆转鼻咽癌细胞的恶性表型。这些证据支持鼻咽癌的癌变机制符合我们提出的鼻咽癌易感基因群主导的多阶段性多米诺骨牌效应机制假说[68]。该假说是对鼻咽癌癌变机制理论的一个有力补充，为具有遗传易感特征的多基因遗传性疾病发病分子机制的阐明提出了新的思路。当然，该假说目前只建立在有限的实验基础之上，需要大量实验来进一步证实。
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