肿瘤抑制基因DOC?2真核表达载体的构建及在卵巢癌细胞HO?8910中的表达鉴定
作者：刘淑娟，韩军涛，辛晓燕，吴元明，陈苏民
【摘要】 目的 构建肿瘤抑制基因DOC?2的真核表达载体pCDNA3.1?p93，将其转入人卵巢癌细胞系HO?8910中，对其基因表达进行相关检测，为进一步研究DOC?2的功能奠定基础。方法 利用XhoI酶切含有p93cDNA的质粒得到p93cDNA 基因片段，将其连接入真核表达载体pCDNA3.1，并通过酶切鉴定。用脂质体介导法将真核表达载体pCDNA3.1?p93 转染HO?8910，通过G418筛选稳定表达克隆；用免疫组化法观察人DOC?2蛋白在HO?8910中的表达。结果 构建了DOC?2的真核表达载体pCDNA3.1?p93，并通过酶切鉴定。免疫细胞化学结果显示pIRES2?EGFP?p93成功转入HO?8910中。结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3.1?p93并在HO?8910中得到稳定表达，为研究DOC?2蛋白的功能奠定了基础。
【关键词】 DOC?2 真核表达载体 卵巢癌
Construction of The Eukaryotic Expression Vector pCDNA3.1?p93 and Its Expression in Ovarian Cancer Cell Line HO?8910
Abstract：Objective To construct an recombinant vector consisted of pCDNA3.1 with DOC?2 cDNA(p93) and transfect it into human ovarian cancer cell line HO?8910 in order to investigate the function of DOC?2 gene on ovarian cancer cell.Methods The recombinant vector (pCDNA3.1?p93) was constructed by XhoI and its correction was confirmed by restriction pattern. Then pCDNA3.1?p93 was transfected into HO?8910 by Lipofectamin and the positive clone 8910?p93 and 8910?pCDNA3.1 were selected by G418. Finally, the expression of DOC?2 in 8910?p93 was proved by immuncytochemical method.Results The recombinant vector pCDNA3.1?p93 was constructed successfully. After being transfected into HO?8910, the pCDNA3.1?p93 positive clone could be harvested by G418 and the steady expression of protein DOC?2 was confirmed by immuncytochemical method. Conclusion After the recombinant vector pCDNA3.1?p93 being constructed, DOC?2 gene could express steadily in HO?8910.This will allow us to study the function of DOC?2 gene in future.
Key words：DOC?2; Eukaryotic expression vector; Ovarian cancer
0 引言
卵巢癌是妇科肿瘤中最常见的恶性肿瘤，其发病机制与抑癌基因的关系一直是该领域研究的热点[1]。1994年Mok等[2]在研究人正常卵巢上皮细胞与卵巢癌细胞的基因差异表达时，发现该基因在正常卵巢上皮细胞中有表达，而在卵巢癌细胞系及组织中无表达，故将其命名为DOC?2（Differentially expressed in ovarian cancer 2）。人类DOC?2位于染色体5p13，长约35kb，含有15个外显子和14个内含子，cDNA共3268bp，编码长度为770个氨基酸的蛋白质，分子量约为82.5KDa [3]。DOC?2是具有信号转导功能的新的磷蛋白，它能抑制多种肿瘤细胞的生长，被认为是一种可能的肿瘤抑制基因，但其作用机制尚未完全阐明。本研究中，我们构建了含有DOC?2cDNA（p93）的真核表达载体，并转染人卵巢癌细胞系HO?8910，为研究DCO?2在卵巢癌发生中的作用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 质粒pCDNA3.1(-)由本校生化教研室陈苏民教授惠赠；含有人DOC2cDNA的质粒p93由美国Dr. Xu Xiangxi惠赠；质粒转染试剂盒（Lipofectamine 2000）购自GIBCO公司；质粒提取及胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；限制性内切酶购自GIBCO 公司；T4 DNA连接酶购自华美生物工程公司；人卵巢癌HO?8910细胞系由妇产科实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 pCDNA3.1?p93的构建 对p93质粒进行测序鉴定，证实DOC2 cDNA 上游23位和下游1154位均有XhoI酶切位点。将p93质粒和pCDNA3.1(-)质粒均行XhoI单酶切，回收连接于表达载体pCDNA3.1中。对重组载体pCDNA3.1?p93进行XhoI及Bam HI酶切鉴定。经鉴定的阳性克隆，提质粒，无水乙醇浓缩沉淀，并用紫外分光光度仪定量待转染用。
1.2.2 细胞的转染及阳性克隆筛选 按每瓶4×105个细胞接种于35ml培养瓶中，细胞达80%融合时，用无血清DMEM换液，备转染用。按Lipofectamin2000转染试剂盒说明将pCDNA3.1?p93质粒转入HO?8910细胞中（同时设空载体和空白对照）。转染48h后，向培养基中加入G418进行筛选，瓶中G418终浓度由100μg/L逐渐升至400μg/L，每3d提高1次浓度。
1.2.3 DOC2在细胞中的表达 筛选出的阳性克隆经传代培养后取其第3代细胞，制备单细胞悬液，爬片固定，利用兔抗人DOC?2抗体[4]，以DAB为显色剂，按ABC反应试剂盒说明进行染色。
2 结果
2.1 重组质粒pCDNA3.1?p93的酶切鉴定 质粒经Xho I单酶切切下大小约2.2kb片段，用Bam HI行单酶切切下大小约0.5kb片段，证实p93片段正向插入pCDNA3.1载体中，构建成重组表达载体pCDNA3.1?p93,见图1。纯化后的质粒浓度测定pCDNA3.1?p93为2.76g/L ，达到脂质体转染的要求。
图1 pCDNA3.1?p93重组体的酶切鉴定图（略）
注：1：pCDNA3.1?p93重组体;2：pCDNA3.1?p93重组体XhoI单酶切;3：pCDNA3.1?p93重组体Bam HI单酶切;4：DL?2000
2.2 阳性克隆的筛选 G418终浓度0.4g/L筛选14d后，空白对照瓶细胞全部死亡，p93转染组和空载体转染组的细胞均有存活，并形成克隆。将G418浓度逐渐降至0.15g/L，待细胞逐渐长满后，进行传代、冻存，并将这种细胞命名为8910?p93。
2.3 DOC2在蛋白中的表达 免疫细胞化学染色结果显示， 8910?p93细胞胞浆内有DOC2蛋白的表达，呈棕黄色颗粒，而HO?8910和8910?pCDNA3.1细胞内均未检测到DOC2蛋白的表达。
3 讨论
DOC?2/DAB2在正常组织中广泛存在，它能抑制多种肿瘤细胞系的生长，包括前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等[5?10]。尤其在卵巢及乳腺中其表达水平很高，对正常卵巢、良性、交界性及浸润性卵巢肿瘤的研究表明，DOC?2/DAB2的表达在恶性卵巢肿瘤组织中下调，在起源于乳腺及卵巢上皮的肿瘤细胞系中，有90%的细胞系用Western blot的方法无法检测到DOC?2/DAB2的表达[10，11]，这些结果显示，DOC?2/DAB2可能是人上皮性卵巢癌中潜在的一个抑癌基因，并且可能在卵巢肿瘤的形成中起重要作用。对人卵巢组织的免疫定位研究表明DOC?2/DAB2主要于卵巢表面上皮层高表达，但DOC?2/DAB2表达的缺失与肿瘤分级无关，提示DOC?2/DAB2表达缺失是肿瘤发生的早期步骤[11]。此外研究发现，DOC?2/DAB2的缺失也发生于高度增生但组织类型为良性的上皮细胞，说明其与卵巢上皮细胞形态学上的转化密切相关，它的发生出现于恶性变前阶段。
本研究中，pCDNA3.1为真核表达载体，具有表达克隆化cDNA所需的启动子、增强子、加poly（A）信号等调控元件，及SV40病毒复制子、G418筛选标记基因等序列，是一个高效真核表达载体，为了便于基因操作，多克隆位点有正反两套酶切位点，本实验采用的是pCDNA3.1（-）载体。我们对p93质粒进行测序，结果证实我们所需的DOC2cDNA（p93）位于该载体的多克隆位点中，上游23位有Xho I酶切位点，下游100位有Hind III、137位有SmalI、154位有Xho I酶切位点。为了将p93克隆入pCDNA3.1（-）真核表达载体中，并且保证DOC2cDNA读框正确，只能选择Xho I 位点行单酶切后进行连接反应。为证实p93正向克隆入载体中，我们选择了DOC2cDNA 第2311位Bam HI酶切位点，同时选择pCDNA3.1（-）多克隆位点中Bam HI酶切位点，由于Xho I位点在这个载体中位于Bam HI上游，故正向克隆在经Bam HI单酶切后应切下大小约0.5 kb片段，而反向克隆则应切下大小约2.3 kb片段。实验结果证实我们成功的克隆了pCDNA3.1?p93重组表达载体。
目的基因的有效转移及其在靶细胞中的表达是基因研究中必不可少的条件。本实验采用的是脂质体介导的基因转移法，它转染效率高，可直接在含血清的培养基中转染，简便快速。基因转染的关键是要有一定纯度的质粒DNA分子，并将其与脂质体按合适比例混合。因此我们将pCDNA3.1?p93质粒纯化，并进行了纯度测定。转染时，我们选用健康且增殖良好的细胞，经传代后，在细胞融合约80%时进行转染，从而保证了转染的可靠性。由于重组载体中含有neo抗性基因，实验中，G418浓度由100μg/L逐渐升至400μg/L，并在400μg/L的浓度下筛选14天后，空白对照组细胞全部死亡，而转染空载体和pCDNA3.1?p93p的细胞仍有存活，并形成克隆，即转染成功的细胞。为进一步确定这一点，我们对阳性克隆传代后的第3代细胞进行了免疫细胞化学染色鉴定，结果不仅证实了DOC2已成功转入HO?8910中，且在其传代过程中得到稳定表达。
外源性DOC2蛋白在卵巢癌细胞中的表达为进一步研究其对细胞生物学特性的影响提供了条件。
【】
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