子宫内膜癌中p16基因状态对端粒酶活性的影响
作者：王琼书, 刘宏, 张蔚, 刘元姣
【摘要】 目的 探讨子宫内膜癌中p16基因状态对端粒酶活性的影响。方法 用PCR技术检测癌组织中p16基因的纯合性缺失及第一外显子异常甲基化，用原位杂交法检测端粒酶的表达。结果 36例癌组织中，9例发生p16基因缺失，12例发生甲基化，未发现基因缺失与甲基化同时存在的病例；29例内膜癌端粒酶表达阳性，阳性率为80.56%。9例基因缺失标本中均有端粒酶的阳性表达,p16甲基化与否对端粒酶的表达影响无差异，但端粒酶阳性率在p16基因失活组明显高于p16基因未失活组。结论 p16基因失活可以导致激活端粒酶端粒，p16基因失活的不同状态端粒酶激活的影响存在差异。
【关键词】 子宫内膜癌 p16基因状态 端粒酶
Effect of Different Type of p16 Gene Expression on The Telomerase Activity in Endometrial Carcinoma
Abstract：Objective To study the effect of MTS1/p16 gene deletion and 5'CpG island methylation on the expression of telomerase activity in endometrial carcinoma.Methods The p16 gene deletion and 5’CpG island methylation were determined by PCR technique, The telomerase catalytic protein subunit mRNA was assessed by in situ hibridization method.Results The p16 gene deletion and 5’CpG island methylation rates in endometrial carcinoma were 25.00%（9/36）and 33.33% (12/36) respectively. The telomerse expression rate was 80.56%(29/36).In 36 cases of endometrial carcinoma, there was 9cases with p16 gene deletion and 12 cases with 5’CpG island methylation,but no case with co?existence,29cases has positive telomerse expressive.Each case with p16 gene deletion has positive telomerse expressive,whereas 5’CpG island methylation has no effect on telomerse expressive. The telomerse expression rate in p16 gene deletion group is higher than that in undeletion group, p16 gene methylation had no effect on telomerse expression .Conclusion p16 gene deactivation would activate Telomerase expression. different type of p16 gene deactivation by p16gene deletion or 5’CpG island methylation has different effect on the Telomerase expression.
Key words：Endometrial carcinoma; MTS1/p16 gene; Telomerase activity
0 引言
近年来的研究认为子宫内膜癌的发生与端粒酶的活化有关[1]。目前尚未见内膜癌中p16基因状态对端粒酶活性影响的报告。结合既往研究，在后续实验中，我们利用原位杂交法检测子宫内膜癌组织中端粒酶催化亚单位编码基因(catalytic protein subunit mRNA，TERT)的表达，探讨子宫内膜癌中p16基因状态对端粒酶活性的影响以及端粒酶活性表达与子宫内膜癌发生关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源 检测的肿瘤标本取自1997年5月～1999年12月武汉大学人民，手术前病人未做任何抗癌。标本离体后30min内采集，液氮速冻，转至-70℃超低温冰箱贮存备用，同期病理报告确定组织类型。子宫内膜癌36例，正常子宫内膜10例。所有病例均经病理证实，内膜癌根据1988年ISGP肿瘤病理分级方案和1988年FIGO分期方案进行分级和临床分期。
1.2 试剂 Telomerase(TERT mRNA)原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。p16引物由Gibco-BRL公司合成,内对照为β?actin。p16 Exon 1 5’GAAGAAAGAGGAGGGGCTC 3’ 5’GCGCTACCTGATTCCAATTC 3’(340bp)。p16 Exon 2 5’GCAAATTGGAAACTGGAAGC 3’ 5’TCTGAGCTTTGGAAGCTCT 3’(509bp)。β?actin 5’CGTCTGGACCTGGCTGGCCGCGACC 3’ 5’CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG 3’(600bp)。
1.3 p16基因外显子1、外显子2缺失的检测 用于扩增的p16 Exon 1和p16 Exon 2引物分别与内对照为β?actin引物混合加入PCR反应液中同时扩增。PCR的循环参数为94℃变性5min，55℃退火2min，72℃延伸3min；后续循环94℃ 1min，55℃1.5min，72℃ 2min；末轮循环94℃ 1min，55℃ 2min，72℃ 10min，总循环数30次。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭溶液中染色。用HPIAS?1000高清晰病理图像分析系统观察、分析DNA泳带，并摄片记录。340bp处无电泳条带为p16基因Exon 1缺失，509bp处无电泳条带为p16基因Exon 2缺失，见图1、2。
图1 p16基因外显子1扩增电泳图（略）
泳道1、3、5为p16Exon1甲基化修饰后扩增带，泳道4、6为p16Exon1甲基化阴性，泳道2为阴性对照
图2 p16基因外显子2扩增电泳图（略）
泳道1为正常子宫内膜p16Exon2扩增，2、3为p16Exon2扩增带4、5为p16Exon2缺失
1.4 p16基因外显子1甲基化的检测 用40u甲基化敏感酶HpaⅡ（37℃）和SmaⅠ完全消化1μg组织DNA2小时，同时用40u非甲基化敏感酶MspⅠ完全消化为对照。进行PCR扩增，若出现p16 Exon 1的扩增产物，证实甲基化存在。
1.5 端粒酶活性检测 组织切片脱蜡、水化后，0.2mol HCl室温下作用10min，4℃预冷的冰醋酸处理15min，1mg/L的蛋白酶K37℃下消化15min，0.2%甘氨酸浸洗，4%多聚甲醛室温固定5min，将配好的杂交液滴加在组织上，覆盖无菌盖玻片，于湿盒中45℃孵育16～20h。洗片后滴加ABC复合液，37℃孵育1h，DAB显色，苏木素复染、脱水、封片。以PBS缓冲液替代杂交液作为阴性对照。含TERT mRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色，固定欠佳的标本端粒酶阳性为核染色。采用HPIAS?1000高清晰图像分析系统进行半定量分析，每张切片随机选取3个腺癌组织，每个癌组织内染色区域的积分光度值，以均值计算每个标本的积分光度。
1.6 统计分析 SPSS8.0软件进行t检验和χ2检验，P＜0.05，差异有显著性。
2 结果
2.1 子宫内膜癌中p16基因状态
正常内膜组织中未发现p16基因纯合性缺失或甲基化；36例子宫内膜癌标本中有9例p16基因纯合性缺失，总缺失率为25.00%，其中单纯Exon 1缺失3例，单纯Exon2缺失5例，Exon 1、 Exon 2同时缺失1例；p16缺失与组织学分级、临床分期呈正相关，G1级与G2、G3级之间差异有显著性（P＜0.05），Ⅰ、Ⅱ期p16缺失低于Ⅲ、Ⅳ期，差异有显著性（P＜0.05）；甲基化分析显示36例癌组织中有12例p16基因5’CpG岛甲基化存在；甲基化与肿瘤组织学分级无关，随临床分期上升，甲基化的发生率呈下降趋势, 而且Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期之间差异有显著性（P＜0.05）；未发现有基因缺失与甲基化同时存在的癌组标本，甲基化和基因缺失在内膜癌中差异无显著性；内膜癌中p16基因总失活率58.33%（21/36）。正常组织中未发现p16基因缺失和甲基化存在。
2.2 子宫内膜癌中端粒酶活性表达
36例子宫内膜癌组织中有29例端粒酶表达阳性，阳性率为80.56%。高分化癌中端粒酶阳性率（71.42%）低于中低分化腺癌（86.36%），差异无显著性，但积分光度分析，G1积分光度11.06±1.97，低于G2、G3的13.27±2.40，随细胞分化程度的下降，端粒酶表达增强差异有显著性。有肌肉浸润（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期）子宫内膜癌端粒酶阳性率83.33%（15/18）高于无肌肉浸润(Ⅰ期)77.78%（14/18），差异虽无显著性，但端粒酶阳性积分光度有随肿瘤临床分期进展而升高，Ⅰ期为10.93±2.16，低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的13.32±2.34，差异有显著性。
2.3 p16基因状态与端粒酶表达关系
p16基因甲基化和端粒酶表达关系：p16甲基化与否对端粒酶的表达影响无差异; p16基因缺失和端粒酶表达关系：9例基因缺失标本中均有端粒酶的阳性表达，表达率为100%,见表1。
表1 p16基因状态与端粒酶表达关系（略）
*P＞0.05，**P＜0.05，△P＜0.05
p16基因失活与端粒酶表达关系：p16基因失活组端粒酶阳性率（90.5%,19/21）高于失活组的66.7%（10/15），P＜0.05；p16基因正常组端粒酶阴性率明显高于失活组的9.5%，P＜0.05；p16基因失活与否对端粒酶的表达影响存在差异。
3 讨论
hTERT作为端粒酶催化亚单位，能够特异性调控端粒酶活性[2]。端粒酶活性在细胞周期不同阶段表现不同，细胞进入G1/S期，端粒酶活性逐渐增高；在S期端粒酶活性最高，而在G2/M期端粒酶活性逐渐丧失。影响细胞周期的物质可对端粒酶活性产生影响。抑癌基因p16是重要的CDK4抑制因子，在细胞周期中起关键性调节作用。其产物p16蛋白通过与CDK4特异性结合而阻止细胞进入G1/S期，对细胞周期起反向调节作用，抑制细胞的分裂与增殖，使受损细胞在复制前修复。目前认为p16基因失活主要以基因甲基化和基因缺失为主，点突变少。p16基因发生异常，导致p16蛋白合成障碍，细胞从G1期进入S期，生长失控导致癌变。p16基因缺失在维持肿瘤恶性表现及细胞永生性方面起重要作用[3]。
部分研究表明端粒酶异常激活与p16基因纯合性缺失有协同关系，端粒酶的激活与p16基因失活有关[4，5]。本实验发现内膜癌中p16基因失活率58.33%（21/36），端粒酶阳性率为80.56%；在正常内膜组织中，无p16基因失活，仅1例增殖期内膜有端粒酶弱表达。说明正常组织中，p16基因未失活时，可以抑制端粒酶活性。一旦p16基因失活，其对细胞周期起反向调节、抑制细胞分裂能力丧失，端粒酶激活，两者在内膜癌的发生、中起着某种协同作用。在肿瘤组织中，p16基因失活组中端粒酶阳性率高于未失活组；而p16基因未失活组端粒酶阴性率也明显高于失活组。我们推测，p16基因失活，导致对细胞周期起反向调节、抑制细胞分裂能力丧失，受损细胞不能在复制前修复，细胞进入S期，被抑制的端粒酶开始激活。实验表明，在p16基因未发生失活的病例中，10例端粒酶表达阳性，说明p16基因失活不是端粒酶激活的唯一原因，端粒酶激活受多因素影响[6]；有2例p16基因失活，而端粒酶亦阴性表达，可能与p16基因失活后激活非依赖端粒酶途径使端粒继续复制而永生有关。
我们既往实验表明，甲基化出现在分期较早、分化较好的病例中，这可能提示甲基化发生肿瘤未扩散阶段，是肿瘤发生发展中的相对早期事件；分期晚、分化差的病例基因缺失率高；p16缺失则是内膜癌的中、晚期事件[7]。随后的实验发现端粒酶阳性率有随肿瘤临床分期进展而升高的趋势。分析p16基因不同失活方式对端粒酶激活的影响，发现12例甲基化标本中，端粒酶阳性率为83.3%，发生基因缺失的9例标本中均有端粒酶的阳性表达，表达率为100%；甲基化使p16基因处于静止状态，同时甲基化与基因组不稳定有关，具有一定的可逆性、局部性[8,9]，我们推测甲基化对端粒酶的抑制同样表现出可逆性和局部性，故早期高分化癌组织即使发生甲基化，可能是低量激活端粒酶，或者在局部激活，这可以解释甲基化的癌组织发生转移少。但是p16基因的缺失是不可逆的，不能合成正常p16蛋白，丧失抑癌功能，使之不能抑制CDK4或CDK6，CyclinD增加，与CDK4结合刺激细胞分裂，导致端粒酶激活高表达，细胞分化差和易发生转移。
由此，我们推测p16基因失活参与了端粒酶的激活，导致肿瘤发生；p16基因失活的不同方式是否对端粒酶激活存在差异，我们将进一步研究。
【】
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