应用基因芯片技术筛选卵巢癌紫杉醇耐药差异表达基因

             作者：张文晶,李红霞,宋磊,张素梅

【摘要】  　　目的 应用基因芯片技术研究人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/Tax300与其亲本细胞OC3(敏感株)之间的基因表达谱差异，筛选耐药相关基因，探讨基因表达谱差异与卵巢癌肿瘤耐药之间相关性。方法 分别提取C3/Tax300与OC3细胞的总RNA并纯化mRNA；将等量的mRNA逆转录，以Cy5和Cy3标记的cDNA做探针，在BiostarH140S基因表达谱芯片上进行杂交。扫描芯片荧光信号图像，用基因图像分析软件对扫描图像进行数字化处理和分析。结果 共筛选出显著表达差异基因134条，其中117种基因表达水平下调，17种基因表达上调，主要涉及细胞信号蛋白和传递蛋白，蛋白翻译合成类以及细胞骨架和运动、离子通道和运输蛋白、代谢、发育等14大类相关基因。下调基因主要为EBNA?3、COP9、StIP1，上调的基因主要是JAK2、HSPS、NADH等。结论 这些基因表达差异与卵巢癌化疗耐药有关。

【关键词】  基因芯片　卵巢癌　耐药相关基因

　　Screening  Differential  Expression of  Taxol?resistance  Related  Gene of  Ovarian Carcinnoma by cDNA  Microarray

　　Abstract：Objective   To study the gene differential  expression of taxol resistance cell line OC3/Tax300 of ovarian carcinnoma compared with other parent cell OC3，screen   drug?resistance related gene by cDNA microarray, and discuss the reiationship between gene expression difference and  drug?resistance.Methods  The cDNA retro-transcribed from equal quantity mRNA derived from OC3/Tax300 and OC3 which were labeled with Cy5 and Cy3 fluorescence as probe respectively. The mixed probe were hybridized with BiostarH140S gene expression chip.  The acquired image was analyzed by software.Results  134 signitificantly differently expressed genes were screened out, of which up-and down regulated genes were 17 and 117 respectively. They were related to 14 kinds of genes. The down-regulated genes were EBNA-3,COP9, StIP1，and so on. The up-regulated genes were JAK2,HSPS,NADH, and so on.Conclusion  These genes related to the mechnisms of drug-resistance of  ovarian cancer.

　　Key words：cDNA microarray;  Ovarian cancer;  Drug-resistance-related gene

　　0  引言
   
　　由于早期诊断困难和化疗耐药，卵巢癌在妇科恶性肿瘤中死亡率占第一位。卵巢癌的发生、与多种基因的突变、失活、表达异常有关，研究常规化疗药物作用下相关基因水平改变，寻找新的耐药相关基因，对探讨卵巢癌化疗耐药机制将起重要的作用。本课题应用基因芯片技术研究卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/Tax300与其亲本细胞OC3(敏感株)之间的基因表达谱差异，筛选耐药相关基因，探讨卵巢癌肿瘤耐药机制。

　　1  材料与方法
   
　　本课题所用卵巢癌耐药细胞模型OC3/Tax300为本实验室自建，具体方法和鉴定结果另文发表[1]。其亲本细胞OC3（敏感株）为军事医学院李春海教授所赠。基因表达谱芯片BiostarH140S由上海博星基因芯片有限责任公司提供。试剂：TRIzol，异丙醇，氯仿，75%乙醇，Milli?Q水（Rnase?free），无水乙醇，杂交试剂盒。方法：分别取OC3与OC3/Tax300细胞，加适量TRLzol匀浆，离心10min取上清液加入氯仿，震荡后放置3min，向上清液中加异丙醇充分混匀再离心10min，加入两次75%乙醇离心弃上清，加入Milli?Q水（Rnase?free）完全溶解RNA沉淀，-80℃保存。经预杂交后加入逆转录引物合成cDNA，以Cy5标记耐药细胞，Cy3标记敏感细胞cDNA做探针，纯化后在BiostarH140S基因表达谱芯片上进行杂交。冲洗玻片晾干后以扫描仪ScanArray4000扫描芯片荧光信号图像，用基因图像分析软件GerePix3.0对扫描图像进行数字化处理和分析。

　　2  结果

　　2.1  总RNA提取结果  耐药细胞及敏感细胞株D260/280值为2.0，电泳可见清析28S、18S条带,见图1。

　　图1  OC3/Tax300 和OC3总RNA 结果（略）

　　2.2  芯片杂交信号散点图  用Cy3和Cy5的荧光信号值作散点图，见图2。

　　图2  Cy3和Cy5的荧光杂交结果（略）

　　2.3  基因芯片筛选结果  见图3。本课题所选两张基因表达芯片，它含有与细胞周期、细胞激素、细胞能量代谢、受体、信号转导、转录因子等相关的14  000条cDNA。与敏感细胞相比，有134种基因表达有显著性差异。有17种基因在耐药细胞中表达水平上调（其荧光强度增强）>3倍，有117种表达下调（其荧光强度减弱）<0.33。对这两张芯片基因表达的特异性进行综合分析和判断，对这些基因功能进行分类，涉及癌基因、DNA合成、修复、细胞信号和传递蛋白、蛋白翻译合成类以及细胞骨架和运动、离子通道和运输蛋白、代谢、发育相关等14类基因。见表1。我们发现细胞信号和传递蛋白EBNA?3、COP9、StIP1表达明显下调，表达上调的基因占小部分，有代表性的是JAK2、HSPS、NADH等，见表2。

　　图3  OC3/Tax300 和OC3基因芯片筛选结果（略）

　　表1  紫杉醇耐药相关基因不同表达分类（略）

　　表2  上调基因（略）

　　
　　3  讨论
   
　　基因芯片是集分子生物学、细胞遗传学、生物化学等多种高新技术为一体的研究手段。本课题所选两张基因表达芯片结果一致：卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/Tax300的细胞信号和传递蛋白EBNA?3、COP9、StIP1表达明显下调。EBNA?3（Epstein?Barr nuclear antigens )是EB病毒编码核蛋白，位于细胞核的新的酶聚合体，主要作为转录调节因子，指导蛋白与蛋白之间相互作用，为核糖核苷酸补救途径的一部分。Krauer[2，3]最近报道：EBNA?3能破坏宿主细胞G2/M控制点，从而影响细    胞周期，增强细胞对药物的敏感性；信号蛋白COP9 （signalosome，CSN）与Rb系统可能共同调节细胞周期稳定性，近来研究表明，许多与CSN相互作用的蛋白是这一激酶的底物，包括c?Jun、p53、ICSBP和p27；对铂类化合物和烷化剂产生耐药性是由于药物在细胞内积聚减少，而铂类化合物摄入减少与通道蛋白或载体蛋白失活有关[4?7]。我们发现离子通道和运输蛋白Sf9和KCNK2明显下调，Sf9长度为2Kb，是一种II型跨膜蛋白，包括406个氨基酸残基[7]；KCNK能可逆性地把钾离子转换进入电压依赖通道，动态调节兴奋性 [8]。
   
　　表达上调的基因中，有代表性的是JAK2、HSPS、NADH等。酪氨酸激酶（Janus kinase 2）JAK2是一类蛋白磷酸酶，能促进蛋白质酪氨酸残基的磷酸化，为重要的细胞信号和传递蛋白，由1132个氨基酸组成，分子量131KD。JAK2与转录结合因子STATS组成一条新的细胞信号传导通道。研究表明，JAK?STAT通道过度激活导致细胞转化。Xie等[9]报道在CML中JAK2介导由BCR/ABL诱导的增殖基因（c?Myc）表达增加，JAK2的激活不仅导致c?Myc表达增加，c?myc蛋白作为序列特异性转录因子，在细胞生长和分化过程中调节基因表达，促进G0期细胞向G1期转化，同时也参与抗凋亡，当c?Myc蛋白表达过度时，导致细胞无限制增殖。我们的资料表明JAK2表达上调与卵巢癌细胞耐药有关，但确切的机制有待进一步研究。热休克蛋白（heat shock proteins，HSPS）是一个多基因家族，参与维持蛋白的正常折叠以形成蛋白的正常结构，并在调节蛋白合成与降解的平衡及蛋白定位中起着重要的作用。当细胞受到各种刺激时，细胞内的HSP的表达增加，快速保护细胞对抗内源性应激的进攻，增强细胞的修复功能及提高细胞对应激的耐受程度。它是很多癌基因通路中的重要组成部分，大量表明HSPS与肿瘤发生、密切相关[10?13]。Ciocca等[14]报道高表达HSPC的乳腺癌细胞对化疗药物有耐药，与本实验中HSPC表达上调结果相符合。30%～40%的乳腺癌、卵巢癌和非小细胞癌性肺癌都表现为ErbB2高表达，对Taxol、cisplatin等药物耐药，效果差。如果这些药物与HSPC的抑制剂合用可能会增强化疗的疗效；还原型辅酶烟胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide reduced,  NADH）位于线粒体膜内，是细胞能量代谢所必需的辅酶，主要功能是经传递链产生ATP。NADH在维持细胞生长、分化和能量代谢中起重要的作用。Zhang等[15?17]研究发现细胞NADH荧光屏水平持续下降反映细胞代谢衰竭和预示细胞死亡发生。细胞损伤不仅可引起细胞碱基损伤、DNA链断裂还可直接作用于线粒体呼吸链，阻断能量供应，诱导细胞凋亡发生，线粒体调控通路作为凋亡的中心环节已被证实。他们还发现NADH具有抑制顺铂诱导肝细胞凋亡作用。NADH通过调控肝细胞线粒体膜电位、胞浆游离Ca离子、pH值和活性氧（ROS）值水平，抑制caspase?3和caspase?8激活，阻止细胞色素（Cyto C）从线粒体基质释放到胞浆，保护多聚酶完整性，并下调抑癌基因p53和上调凋亡抑制基因bcl?2的表达，阻断顺铂引起的凋亡。细胞凋亡与肿瘤细胞的耐药性有着内在的密切关系，促凋亡基因的缺失和抗凋亡基因的过度表达都可导致细胞对化疗药物产生耐药。
   
　　紫杉醇（Paclitaxel）对包括卵巢癌在内的恶性肿瘤有突出的疗效。但随之产生的耐药现象日益严重，最终导致化疗失败。紫杉醇耐药可能涉及多种因素和机制，我们应用基因芯片技术研究卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/Tax300与其亲本细胞OC3(敏感株)之间的基因表达谱差异，筛选与卵巢癌肿瘤耐药相关的基因，可能为进一步探讨卵巢癌肿瘤细胞耐药机制提供了新的途径。

【文献】
  　　1］ 李红霞, 刘冠媛，周友珍,等.卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/PLX3及OC3/PLX5和建立及其生物学特性[J]. 中华医学研究杂志，2004, 3(2) ：1?5.

　　［2］ Krauer K G, Buck M, Belzer D K, et al. The Epstein?Barr virus nuclear antigen?6 protein co?localizes with EBNA?3 and survial of motor neurons protein[J]. Virology, 2004, 318(1): 280?294.

　　［3］ Krauer K G, Burgess A, Buck M, et al. The EBNA?3 gene family proteins disrupt the G2/M checkpoint[J]. Oncogene, 2004, 23(7): 1342?1353.

　　［4］ Bech?Otschir D, Seeger M，Wolfgang D, et al. The COP9 signalosome: at the interface between signal transduction and ubiquitin?dependent proteolysis[J]. J Cell Sci, 2002, 115(Pt 3): 467?473.

　　［5］ Bech?O D, Kraft R, Huang X, et al. COP9 signalsome?specific phosphorylation targets p53 to degradation by the ubiquitin system[J]. J EMBO, 2001, 20(5): 1630?1639.

　　［6］ Seeger M, Kraft R, Ferrell K, et al. A novel protein complex involved in signal transduction possessing similarities to 26S proteasome subunits[J]. J FASEB,1998, 12(3): 469?478.

　　［7］ Kobayshi M, Sugumaran G. Molecular cloning and characterization of a human uron sulfotransferase that sulfates iduronyl and glucurony residues in dermatan/chondroitin sulfate[J]. J Biol Chem, 1999, 274(15):10474?10480.

　　［8］ Bockenhauer D, Zilberberg N, et al. KCNK2: reversible conversion of a hippocampal potassium into a voltage?dependent channel[J]. Nat Neurosci, 2001 , 4(5): 457?458.

　　［9］ Xie S, Lin H, Sun T, et al. Jak2 is involved in c?Myc induction by Bcr?Ab1[J]. Oncogene, 2002,21(47): 7137?7146.

　　［10］Morimoto RI. Regulation of the heat shock transcriptional response cross talk between a family of a heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulatiors[J]. J Genes Dev,1998, 12(1): 3788?3796.

　　［11］Jolly C, Morimoto RI. Role of the heat shock response and molecular chaperones in oncogenesis and cell death[J]. J Natl Cancer Inst. 2000, 92(1): 1564?7154.

　　［12］Smith DF. Chaperones in signal transduction. [M]. P Lund(Ed.) Oxford University Press. Oxford and NY, 2001, 6(4):165?178.

　　［13］Smith DE, Whitesell L, Katsanis E. Molecular chaperones: Biology and prospects for pharmacological intervention[J]. J Pharmacol Rev,1998, 50(3): 493?514.

　　［14］Ciocca DR,Fuqua SA,Lock?Lim S, et al. Response of human breast cancer cells to heat shock and chemotherapeutic drugs[J]. J Cancer Res, 1992, 52(9): 3648?3654.

　　［15］Zhang JR, Vrecho K, Nading K, et al. Reduced coenzyme I regulation expression of c?myc, c?cerB?2, bcl?2, p?53, and PCNA on PC12 cells damaged by rotenone[J]. Int J Modern Cancer Ther, 1999, 2(2): 8?9.

　　［16］Zhang JR, Vrecho K, Nading K, et al. The reduced coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) rescues PC12 cells from apoptosis[J]. J Tumor Mark Oncol, 1998, 13(3) : 5?6.

　　［17］Zhang JR, Vrecho K, Nading K, et al. Regulation of CD95, C?fos, c?myc, and bcl?2 involved in the recovery of NADH on PC12 cells from apoptosis following serum deprivation[J]. Int J Modern Cancer Ther,2000, 3(1): 38?39.