肿瘤相关基因NAG6在胃癌中的表达和限制性片段长度多态性分析
【摘要】 目的 检测NAG6基因在胃癌及癌旁组织中的表达，探讨此基因在胃癌发生、中的作用以及它在胃癌中的基因结构变化。方法 采用RT?PCR，Northern杂交，点杂交方法检测42例胃癌和癌旁组织中NAG6的表达；RFLP分析检测该基因在胃癌中是否存在基因结构的改变。结果 59.5%（25/42）的胃癌组织中NAG6基因表达缺失,NAG6在胃癌组织中的表达较癌旁组织显著下调（P<0.005）,但NAG6表达下调与胃癌组织类型、淋巴结或远处转移无明显关系（P＞0.05）。点杂交证实NAG6在胃癌组织中表达下调。RFLP分析发现NAG6在7例胃癌及癌旁组织中的基因型为11.5Kb/5.0Kb,在3例癌组织中发现5.0Kb这条等位基因片段的杂合性丢失。结论 NAG6基因在胃癌组织中表达显著下调，该基因的表达下调可能在胃癌的发生和发展过程起到一定的作用，但是与胃癌的转移无明显关系。而遗传物质的丢失可能与该基因表达下调有关。提示NAG6基因可能为定位于7q31?32的与胃癌相关的侯选抑瘤基因。
【关键词】 胃癌 抑瘤基因 基因表达 RFLP
Expression of Tumor Related Gene NAG6 in Gastric Cancer and RFLP Analysis
Abstract：Objective To examine the expression level of NAG6 gene in gastric cancer and matched paracancerous tissues, and to investigate its role in the occurrence and development of gastric cancer, also to study if the genetic structure of NAG6 was alteration in gastric cancer. Methods Reverse transcription?polymerase chain reaction (RT?PCR), Northern blot analysis and Dot hybridization were used to compare the expression level of NAG6 gene in 42 cases of human gastric cancer tissues with their matched paracancerous tissues of the same patients respectively. In addition, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analysis was adapted to study if the genetic structure of NAG6 was alteration in gastric carcinomas. Results The expression of NAG6 was absent in 57.1% gastric cancer tissues (25/42). The expression of NAG6 was significantly down?regulated in gastric cancer tissues compared with that in matched paracancerous tissues (P<0.005). However down?regulation of NAG6 was not relevant to pathologic type and lymph?node or distance metastasis of gastric cancers（P>0.05）. Dot hybridization confirmed the results of RT?PCR. Furthermore, the results of EcoRⅠ?RFLP analysis of NAG6 gene demonstrated that 3 of 7 cases of gastric cancer showed loss of 5kb fragment in comparison with their matched paracancerous tissues. Conclusion NAG6 gene was significantly down?regulated in gastric cancer tissue. The down?regulation of this gene may play a role in occurrence and development of gastric cancer, however it may be not associated with lymph?node or distance metastasis. The loss of genetic materials may be the causes of down?regulation of NAG6 expression. This seems to suggest that NAG6 may represent a candidate of putative tumor suppressor gene at 7q31?32 locus associated with gastric carcinoma.
Key words：Gastric Cancer;Tumor suppressor gene;Gene expression;RFLP
0 引言
胃癌是死亡率最高的恶性肿瘤之一，尽管近年来胃癌的发病率在欧美等国家逐渐下降。但在包括我国和日本在内的远东地区，胃癌仍是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1,2]。众所周知，胃癌的发生与发展涉及多个癌基因的活化和抑瘤基因的失活，后者包括染色体上某些位点等位基因的杂合性丢失以及抑瘤基因的突变等。但胃癌发病的分子机制迄今尚未得到阐明[3,4]。NAG6是我们采用EST介导的定位候选克隆策略从7q31?32这个多种肿瘤共同缺失区克隆的新基因，GenBank基因登录号为：AF156971。对该基因功能的初步研究发现它在鼻咽癌活检组织和鼻咽癌上皮细胞株中表达下调甚至缺失。为了进一步明确此基因在胃癌中是否存在表达改变，是否参与胃癌的发生、发展，我们采用RT?PCR、Northern杂交、点杂交方法检测该基因在胃癌及癌旁组织中的表达。为了更进一步了解NAG6基因在胃癌中是否存在基因结构改变导致基因表达异常，我们采用了RFLP分析方法，旨在为胃癌多基因遗传的分子本质提供新的分子生物学证据。
1 材料和方法
1.1 组织标本
收集湘雅2000年1月至6月病理诊断为为胃癌的新鲜手术标本42例及其癌旁组织（手术切缘处，距肿瘤5cm以上），所有癌旁组织经病理检查证实为正常组织，未见癌及癌前病变。经常规处理后，放入液氮罐内储存待用。其中低分化腺癌30例，高分化腺癌4例，黏液腺癌2例，印戒细胞癌6例, 有淋巴结及远处转移者共6例。 年龄在30～68岁之间（平均年龄51.7岁），男22例，女20例。术前未经化疗或放疗。
1.2 方法
1.2.1 RT?PCR 按照TRIzol试剂盒（GIBICOLBRL公司）说明抽提胃癌、癌旁组织总RNA。RNA纯度为：OD260/OD280＞1.8。用DNase?Ⅰ消化RNA中痕量DNA后,按逆转录试剂盒（Promega公司）说明，取1μl逆转录产物为模板，同时扩增GAPDH和目的基因（NAG6），PCR反应参数：95℃变性5min；94℃50s， 56℃50s；72℃1min，共35个循环，72℃延伸10 min。取反应产物10μl采用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物通过PCR Designer 1.03 软件设计引物序列，由大连宝生物工程公司合成。用于NAG6基因表达检测的引物序列为： NAG6F1,5’?GGCACTGGAGTACAAAGACA?3’;NAG6R1,5’?TTACTTTTCCCATTTGCTCA?3’; PCR产物长度为680bp。
GAPDHF1,5’?GTCATCCATGACAACTTTGGTATC?3’;GAPDHR1,5’?CTGTAGCCAAATTCGTTGTCATAC ?3’; 产物长度475bp。
1.2.2 Northern杂交检测基因的表达 按“分子克隆实验指南”操作程序操作，分别取30μg胃癌与癌旁组织总RNA，在1％琼脂糖甲醛变性胶上电泳。纸巾法转至尼龙膜上后紫外交联, 并于80℃真空干燥2h。以α?32P?dCTP为标记物，取RT?PCR扩增的NAG6产物，用随机引物标记盒(Promega 公司)标记NAG6 cDNA探针，同一张膜先后与目的探针和GAPDH探针68℃杂交过夜。2×SSC、0.05％SDS室温下淋洗膜3次，然后37℃洗膜30～40min,0.1×SSC、0.1％SDS 50℃洗膜40min,?70℃曝光，放射自显影。
1.2.3 点杂交 按PCR产物回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)说明回收纯化RT?PCR扩增的NAG6、GAPDH产物，碱变性后用微量加样器点于尼龙膜上后紫外交联，80℃烤2 h。以α?32P?dCTP(北京福瑞公司)为标记物，胃癌及其癌旁组织RNA为模板（癌与癌旁组织各取10例，每例取RNA1μg，混匀），采用逆转录试剂盒分别标记cDNA探针，与相应的膜杂交。洗膜，?70℃曝光，放射自显影。
1.2.4 RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）分析 按“分子克隆实验操作指南”提取和纯化胃癌和癌旁组织标本7对的DNA，用50～100单位的EcoRI限制性内切酶完全消化5～10μg 的胃癌和癌旁组织基因组DNA，0.7% 琼脂糖,1×TAE,30～40伏电压电泳过夜。用毛细管法将电泳分离的DNA转移至尼龙膜上,紫外交联,然后80℃真空烤膜2h。同上标记NAG6同位素探针,杂交,洗膜,放射自显影。
1.3 统计学处理
采用两样本率比较的χ2检验和四格表确切概率法，检验水准均取P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 NAG6基因在胃癌与癌旁正常组织中的表达
NAG6基因扩增产物大小约680bp，42例癌旁组织均检测到NAG6较强的扩增产物，59.5%（25/42）的胃癌组织检测不到NAG6扩增产物，见图1，两组间的NAG6表达缺失率有显著性差异(χ2=32.8,P＜0.005)，提示NAG6在胃癌组织中表达明显下调。NAG6在低分化腺癌、高分化腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌中的表达缺失率分别为63.3%、50%、50%、66.7%,合并淋巴结或远处转移的胃癌组NAG6表达缺失率为66.7%（4/6），无转移组为58.3%(21/36)，统计分析显示NAG6表达缺失与组织学类型和转移无明显相关（P＞0.05），见表1。
为证实RT?PCR结果，我们采用Northern杂交进行验证，NAG6 cDNA片段标记为探针，分别与胃癌、癌旁组织总RNA进行Northern杂交，结果表明NAG6在胃癌及癌旁组织中均未检测到杂交信号，同一张膜与GAPDH探针杂交，信号均为阳性，提示此基因在胃癌和癌旁组织中表达丰度很低。为进一步证实RT?PCR结果，我们采用点杂交进行验证，结果显示NAG6与癌旁组织cDNA杂交有较强杂交信号，而与胃癌cDNA探针杂交显示的信号明显减弱，证实NAG6在胃癌组织中存在表达下调,与RT?PCR结果相符，见图2。
图1 RT?PCR检测NAG6在胃癌及癌旁组织中的表达（略）
M：PCRmarker; N1?10：癌旁组织；T1?10：胃癌组织
表1 NAG6表达与胃癌组织学类型及转移关系（略）
P＞0.5,a、b、c分别与低分化腺癌比较
图2 NAG6、GAPDH与胃癌及癌旁组织cDNA探针点杂交结果（略）
1、癌旁组织；2胃癌组织
2.2 NAG6基因在胃癌中的限制性片段长度多态性（RFLP）分析
7例胃癌及其配对癌旁正常组织标本的EcoRⅠ?RFLP 分析表明， NAG6基因型均表现为11.5kb和5.0kb两条杂交带,其中3例（病例2#、5#和7#） 胃癌基因组DNA中丢失5.0kb这个等位基因片段，表现为典型的杂合性丢失现象，见图3。
图3 NAG6在胃癌和配对癌旁正常组织中的EcoRⅠRFLP分析（略）
N：癌旁组织；T：癌组织
3 讨论
NAG6为我们最近采用定位候选克隆策略从多种肿瘤共同缺失区7q31?32区域所克隆出的肿瘤相关新基因。用它的全长cDNA序列在GenBank中搜索，未发现任何同源性基因；用这个基因ORF核苷酸编码的氨基酸序列在Swiss?prot蛋白数据库中也未发现任何同源性蛋白质，说明NAG6基因是全新的基因，已获美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)收录，基因登录号分别为AF156971。利用ScanProsite软件预测该基因蛋白产物有4个PKC磷酸化位点，推测NAG6基因的活化可能受磷酸化作用的调控。对它的初步研究发现，该基因在鼻咽癌活检组织中表达明显下调，它在鼻咽癌中表达下调可能与遗传物资的丢失和基因的高甲基化等因素有关。因此推测NAG6基因可能为鼻咽癌的一个抑瘤基因侯选者,该基因的表达下调在鼻咽癌的发生中起到一定的作用[5,6]。
而近年细胞遗传学和分子遗传学研究亦证实，人类7号染色体的长臂上某些位点高频率的等位基因杂合性缺失（Loss of heterozygosity，LOH）现象是胃癌中常见分子事件[7?11]。Nishizuka等[9]检测了53例胃癌患者7q区域的LOH，发现其缺失频率为34%（18/53）；Kuniyasu等[10]利用5个多态性标志物检测98例胃癌患者7q的缺失情况，发现32%（26/98）的患者中存在一个或多个位点的LOH；夏建川等[11]检测了28例原发性胃癌患者，发现7号染色体的缺失是原发性胃癌的特征性结构改变。并且许多进一步的研究确定7q32?qter是7号染色体上最常见的高频率的LOH区域,推测该区域可能存在与胃癌相关的一个或多个候选抑瘤基因，此区域的基因缺失与胃癌发生具有密切关系。NAG6基因定位于胃癌最常见的染色体改变区域，是否在胃癌中也存在类似鼻咽癌中的表达差异，是否参与胃癌的发生发展目前尚未见报道。我们研究发现，NAG6在胃癌组织中存在高频率的表达缺失（ P＜0.005），点杂交亦证实此基因在胃癌中表达明显降低。提示NAG6可能为与胃癌相关的候选抑瘤基因，此基因缺失可能为胃癌发生过程中一个重要的遗传事件，与胃癌的发生关系密切。但NAG6基因表达下调与组织类型以及有无淋巴结或远处转移无显著相关（P＞0.05），提示此基因的改变可能发生于胃癌的早期，而未参与胃癌的侵袭转移。
为了研究NAG6基因在胃癌中表达下调的原因，我们采用RFLP分析方法检测该基因在胃癌组织中是否存在基因结构改变。结果发现与癌旁组织比较，NAG6基因在3例的胃癌组织基因组DNA中丢失5.0kb这个等位基因片段；在以往的研究中也曾发现NAG6基因在6例鼻咽癌活检组织中丢失3.0kb这个等位基因片段（与配对的外周血对比）[5]。这些结果说明该基因在这两种恶性肿瘤中存在基因结构改变，初步推测遗传物质的丢失可能是它在胃癌中表达下调的原因之一。
综上所述，NAG6基因在胃癌组织中表达显著下调，并且该基因在胃癌中还存在遗传物质丢失，推测它可能为定位于7q31?32区域的与胃癌和鼻咽癌相关的一个侯选抑瘤基因。NAG6基因在胃癌中的缺失必将导致其所处的特定生化通路平衡失调，促进胃癌的发生、发展，但该基因抑瘤机制尚未完全明了。目前我们正在深入研究该基因的功能。
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