直肠癌组织中TAM计数与EMMPRIN、IL?8、MCP?1表达的相关性
【摘要】 目的 研究直肠癌组织中TAM计数及EMMPRIN、IL?8、MCP?1表达水平并探讨其相互关系和临床病理意义。方法 41例直肠癌手术切除标本和15例上切缘非癌粘膜组织常规制作石蜡包埋切片，免疫组化分别染TAM、EMMPRIN、IL?8和MCP?1。结果 癌组织TAM计数及EMMPRIN、IL?8、MCP?1表达阳性率明显高于非癌组织；高、中分化腺癌和肿块最大径≤5cm病例，TAM计数明显低于低分化腺癌和肿块最大径>5cm病例；癌细胞未浸及浆膜层病例TAM计数及EMMPRIN、MCP?1表达阳性率明显低于癌细胞浸润浆膜层病例；无淋巴结转移病例TAM计数及EMMPRIN、IL?8、MCP?1表达阳性率明显低于淋巴结转移病例；EMMPRIN、IL?8和MCP?1表达阳性直肠癌TAM计数明显高于阴性病例；直肠癌中EMMPIN、IL?8和MCP?1表达之间存在密切正相关系(P<0.05)。结论 TAM计数及EMMPRIN、IL?8和MCP?1表达可能是反映直肠癌发生，生物学行为和预后的重要标记物。
【关键词】 直肠癌；肿瘤相关巨噬细胞；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子；化学趋化因子；免疫组织化学
Key words：Rectal cancer; Tumor?associated macrophage； Extracellular matrix metalloproteinase inducer; Chemokines; Immunohistochemistry
癌组织内浸润的巨噬细胞称肿瘤相关巨噬细胞(tumor?associated macrophage, TAM), 近年发现TAM浸润数量与恶性肿瘤生物学行为和预后密切相关[1，2]。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metall?oproteinase inducer, EMMPRIN)能诱导基质金属蛋白酶的生成，与恶性肿瘤侵袭潜能，转移发生及预后密切相关[3，4]。化学趋化因子已发现50余种，均为小分子蛋白质，IL?8属CXC亚家庭主要成员，单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein?1, MCP?1)为CC亚家族主要成员。近年发现IL?8和MCP?1表达水平也与恶性肿瘤发生进展、血管生成及预后密切相关[5?10]。作者应用免疫组化方法研究TAM计数及EMMPRIN、IL?8、MCP?1表达水平，探讨它们之间的相互关系及其临床病理意义。
1 资料与方法
1.１ 临床病理资料
收集我院2001年1月～2003年6月直肠癌手术根治术标本41例，男22例，女19例，34～80岁，平均年龄(56.9±11.9)岁。病理类型：腺癌36例，印戒细胞癌3例和粘液腺癌2例。分化程度：高分化6例，中分化28例，低分化7例；癌细胞未浸及浆膜层6例，浆膜层35例。肿块最大径<5cm 28例，>5cm 13例；有26例发生区域淋巴结转移。另收集15例相同直肠癌根治术标本上切缘的非癌直肠粘膜组织，HE染色，光镜观察粘膜上皮轻度不典型增生3例，中度和重度不典型增生各2例，8例为完全正常肠粘膜。上述标本经10%福尔马林固定后常规制作石蜡包埋连续切片，4μm厚。
１．2 主要试剂
鼠抗人CD68单克隆抗体，免抗人EMMPRIN、IL?8、MCP?1多克隆抗体，生物素标记羊抗鼠IgG，生物素标记羊抗兔IgG，ABC试剂，以及DAB?HCL显色试剂盒均购自武汉博士德公司。
１．3 方法
TAM、EMMPRIN、IL?8和MCP?1染色方法均为常规ABC免疫组化法。TAM免疫组化反应产物定位于胞浆和胞核， 见图1，EMMPRIN，IL?8和MCP?1免疫组化反应产物定位于胞浆，见图2～4。TAM计数方法参照Ohno法，高倍镜下随机观察10个癌组织视野，计数各视野内TAM数，均值为该病例TAM计数[1]。将切片中EMMPRIN、IL?8和MCP?1阳性细胞率≥20%为阳性病例，<20%为阴性病例。以博士德公司提供的阳性切片作为阳性对照，以0.01 MPBS液(pH 7.4)替代一抗作为阴性对照。
1.4 统计学处理 将所得数据输入SPSS10.0软件包进行t检验、χ2检验，Fischer精确概率法及等级相关分析，检验水准α=0.05。
2 结果
41例直肠癌TAM计数为（26.8±8.5）个/HP，15例残端非癌肠组织为（16.4±7.2）个/HP，两者存在高度显著差异(t=4.33, P<0.01)。高分化、中分化腺癌及浸润至肌层、肿块最大径≤5cm和无淋巴结转移病例TAM计数明显低于低分化(高分化：t=3.89, P<0.01；中分化：t=2.77, P<0.01)、浸润至浆膜层(t=2.67, P<0.01)、肿块最大径>5cm(t=2.62, P<0.01)及淋巴结转移病例(t=2.68, P<0.01)，见表1。
41例直肠癌EMMPRIN、IL?8和MCP?1阳性表达病例分别为24例(58.5%)、23例(56.1%)和28例(68.3%)，15例残端非癌肠组织阳性病例分别为4例(26.7%)、3例(20.0%)和4例(26.7%)，均存在显著或高度显著差异(EMMPRIN:χ2=4.46, P<0.05; IL?8:χ2=5.75, P<0.05, MCP?1:χ2=7.77, P<0.01)。高分化、中分化腺癌及浸润至肌层、肿块最大径≤5cm和淋巴结未转移病例EMMPRIN、IL?8和MCP?1表达阳性率较明显低于低分化，浸润至浆膜层及淋巴结转移病例，见表1，但与患者性别、年龄、病理类型等其他临床病理特征无明显关系(P>0.05)。
EMMPRIN、IL?8和MCP?1阳性病例TAM计数均明显高于其阴性病例，均有高度显著性差异(P<0.01)，见表2。24例EMMPRIN阳性病例中IL?8阳性17例和MCP阳性20例，17例EMMPRIN阴性病例中IL?8阴性11例和MCP?1阴性9例，EMMPIN与IL?8、MCP表达呈密切关系(IL?8:χ2=5.10, P<0.05; MCP?1:χ2=6.05, P<0.05)；23例IL?8阳性病例中MCP?1阳性19例，18例IL?8阴性病例中MCP?1阴性9例，两者表达存在密切关系(χ2=4.96, P<0.05)。表1 TAM计数及EMMPRIN、IL?8、MCP?1表达与直肠癌临床病理特征关系 注：与低分化、浸润浆膜层，肿块最大径>5cm及淋巴结转移病例比较，*P<0.05,**P<0.01表2 直肠癌中EMMPRIN、IL?8、MCP?1阳性病例TAM计数与阴性病例比较
3 讨论
本组资料发现直肠癌组织中TAM计数明显高于非癌直肠粘膜组织，且高中分化腺癌、癌细胞浸润至肌层、肿块最大径≤5cm和无区域淋巴结转移病例TAM计数均明显低于低分化、癌细胞浸润至浆膜层、肿块最大径>5cm和区域淋巴结转移病例，均有高度显著差异(P<0.01)，其结果与国外报道一致。提示TAM计数可能是反映直肠癌发生发展、转移状况及预后的重要生物学标记物，TAM计数高的直肠癌恶性度高、进展快、易发生淋巴结转移及预后差。
近年发现多数恶性肿瘤能自分泌EMMPRIN，许多恶性肿瘤细胞表达明显增高，而其相应来源的良性病变和正常细胞低表达或不表达。国外学者均发现EMMPRIN通过诱导MMPs的产生而影响恶性肿瘤的生物学行为和预后，阳性表达者多恶性度高、易扩散和转移及预后差，认为EMMPRIN是评估恶性肿瘤侵袭或转移及预后的重要生物学标记物[3，4]。本组资料发现直肠癌组织EMMPRIN表达阳性率明显高于非癌直肠粘膜组织(P<0.05)；高分化、癌细胞浸润至肌层及无淋巴结转移病例EMMPIN表达阳性率明显低于低分化、癌细胞浸润浆膜层及淋巴结转移病例。其结果与国外报道较一致，说明EMMPRIN也可能是反映直肠癌恶性程度，侵袭和转移潜能及预后的重要生物学标记物，其机制可能与诱导MMPs产生和影响肿瘤微环境有关，但需更进一步研究。
近年国外学者较广泛地研究了IL?8、MCP?1等化学趋化因子在恶性肿瘤中表达及其生物学意义，发现IL?8、MCP?1除有趋化炎性细胞向肿瘤组织迁移浸润外，在肿瘤组织微环境调控中起极其重要作用，如促肿瘤血管生成和肿瘤生长及增强侵袭和转移能力等[5?10]。大部分文献均发现阳性表达的恶性肿瘤进展快、微血管密度高及预后差[5?10]。本组资料发现直肠癌组织中IL?8、MCP?1表达阳性率明显高于非癌直肠粘膜组织(P<0.05或P<0.01)，区域淋巴结未转移病例IL?8、MCP?1表达阳性率明显低于区域淋巴结转移病例(P<0.01)，高、中分化腺癌和癌细胞浸润至肌层病例MCP?1表达阳性率明显低于低分化腺癌和癌细胞浸润浆膜层病例，其中与中分化腺癌和癌细胞浸润至肌层病例有显著差异(P<0.05)。说明IL?8、MCP?1表达与直肠癌淋巴结转移有密切关系，具有促转移发生作用，其机制可能与其促血管生成、趋化炎性细胞向肿瘤组织迁移浸润有关。
国外学者研究认为肿瘤组织内TAM浸润数量与其瘤细胞分泌的一些化学趋化因子有关，尤与IL?8、MCP?1关系更密切[6，8?10]。但EMMPRIN表达是否与肿瘤组织内TAM浸润数量有关未见文献报道。本组资料发现EMMPRIN、IL?8、MCP?1表达阳性病例TAM浸润数量明显高于阴性病例。说明三者均有吸引和趋化TAM向直肠癌组织内浸润和迁移的作用。另外，本文发现EMMPRIN、IL?8和MCP?1表达均存在着密切正相关系，说明三者在调控肿瘤微环境及肿瘤生物行为和预后方面存在密切关系，其机制需进一步深入研究。
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