银杏叶提取物对胶质瘤细胞NF?κB表达和NO生成的调控

【摘要】  目的 研究银杏叶提取物（EGb761）对C6胶质瘤细胞核转录因子?κB（NF?κB）表达和可诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、一氧化氮（NO）生成的影响。方法 以脂多糖（LPS）和佛波酯（PMA）诱导体外培养的C6胶质瘤细胞表达可诱导型一氧化氮合酶、产生大量NO，应用激光共聚焦成像系统和NO荧光探针监测细胞内NO浓度变化，逆转录基因扩增技术和蛋白质印迹技术检测EGb761对C6胶质瘤细胞中iNOS基因表达的影响，并探讨这一调控作用的分子机制。结果 EGb761能明显降低C6胶质瘤细胞中iNOS mRNA和蛋白的表达、减少NO的生成，抑制IκB?α的降解和阻止p65/RelA进入细胞核。结论 EGb761可通过NF?κB信号通路对C6胶质瘤细胞iNOS基因表达和NO的生成进行调控。

【关键词】  银杏叶提取物；胶质瘤细胞；可诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮；核转录因子?κB
    Regulatory Effect of Ginkgo Biboba Extract on the Expression of NF?κB and Nitroxide Production in Glioma Cells

     Key words：EGb761; Glioma cell；  iNOS;  Nitric oxide;  NF?κB

    银杏为最古老的中生代孑遗稀有植物之一，属裸子植物门银杏纲银杏科植物，现仅存一科一属一种，有裸子植物“活化石”之称。银杏树的根、叶、皮及种子均可药用。银杏叶入药始于明代，传统医学用银杏叶哮喘、支气管炎和老年性心血管疾病，但叶中含有氢氰酸，可加速心率，副作用大。20世纪60年代后，德、法等欧洲国家先后开展了对银杏叶的研究。1965年，德国威玛舒培博士(Dr. Willmar Schwabe)药厂正式上市全球第一个银杏叶标准提取物EGb761（ginkgo biloba extract），其质量指标为黄酮苷≥24%，萜内酯≥6%，银杏酸≤10ppm，此标准为许多国家所公用。但国际上并没有制定正式统一的标准，也没有统一的含量测定方法，各厂商都有自己的质控指标，且不同的地区、不同的季节、不同的加工方法和不同的制剂工艺对银杏叶中药效成分影响很大。

    资料表明银杏叶含有多种药用活性成分，其有效成分主要是银杏内酯和黄酮类(以槲皮素、山奈素、水杨梅素为主)[1]。近年来，生物类黄酮抗氧化活性倍受人们的重视，生物类黄酮是最强的抗氧化剂之一。且分子较小，水溶性强，易被机体吸收，无蓄积作用，能清除自由基，提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，抗细胞凋亡[2?4]；调节器官组织功能，有效延缓衰老[5]。已有研究发现EGb761能抑制巨噬细胞以及内皮细胞中iNOS基因表达[6]。本研究拟以LPS和PMA诱导体外培养的C6细胞为实验模型，采用激光共聚焦、RT?PCR、Western blot分析等技术研究EGb761对C6胶质瘤细胞NF?κB表达和NO生成的调控。

    1  材料和方法

    1.1  材料  实验试剂主要有：C6胶质瘤细胞系（中科院上海细胞生物学研究所）；DMEM培养基、胎牛血清（Hyclone公司）； UNIQ?10柱式总RNA提取纯化试剂盒（上海生工公司）；Access QuickTM RT?PCR试剂盒（Promega公司）等；EGb761（法国Beaufour Ipsen 制药公司Marie?Therses Droy?Lefaix博士惠赠）。

    实验仪器有：CO2培养箱（Napco，USA）；紫外分光光度计（Beckman，USA）；电泳仪（EPS 301，USA）；PCR仪（Eppendorf，Germany）；凝胶成像系统（UVP，USA）；激光共聚焦扫描荧光显微镜（Olympus，Japan）等。

    1.2  细胞培养  将复苏的C6胶质瘤细胞混悬于DMEM培养基中（含10%灭活胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素），置37℃、含5%  CO2的细胞培养箱内培养，待细胞长成单层后（约3d）按1∶4传代。

    1.3  细胞内NO水平检测  将处于对数生长期的C6细胞用0.1%的胰酶消化，用含10%胎牛血清的培养基重悬细胞，配成1×105的细胞悬液，接种于4cm培养皿中，每皿2ml，贴壁2h后换成无血清培养基，分为3组，即对照组、诱导组（LPS 1μg/ml和PMA  400ng/ml）和药物组（在加入LPS和PMA前2h加EGb761 50μg/ml），12h后换成带DAF?2?DA探针（2.5 μmol/L）的培养基，培养1h，用培养基洗涤细胞3次，置显微镜下观察，激发波长488nm。

    1.4  亚硝酸盐测定  细胞接种于24孔培养板，1×105/孔，分为对照组、诱导组和药物组3组，对照组不加诱导剂和药物，诱导组加入诱导剂LPS（终浓度1μg/ml）和PMA（终浓度400ng/ml），药物组在加入诱导剂前2h先加入EGb761（终浓度50μg/ml），取上清培养液加入等量Griess试剂，室温放置10min，用Bekman DU?640可见?紫外分光光度计，在546nm处测定其吸光度A值，以亚硝酸钠为标准，绘制标准曲线，求出亚硝酸盐的含量，并换算成nmol/L×105个细胞。

    1.5  RT?PCR分析  分别提取各组总RNA，RT?PCR试剂盒进行扩增以分析iNOS基因的mRNA表达，β?actin为内参物。PCR引物设计参照[7]，由上海生工公司合成。引物序列如下：iNOS：5’?AGA GAG ATC CGG TTC ACA?3’/ 5’?CAC AGA ACT GAG GGT ACA?3’， 扩增片段长度376bp；β?actin： 5’?TCC TTC GTT GCC GGT CCA CA?3’/5’?CGT CTC CGG AGT CCA TCA CA?3’，扩增片段长度509bp。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，UVP扫描分析。

    1.6  蛋白质印迹分析  用细胞刮刀将各组细胞刮下，离心收集，加入细胞裂解液A(细胞膜裂解)，混匀后冰浴15min，13000g离心15min，上清作为胞浆蛋白提取物进行蛋白质印迹分析，用于分析iNOS基因的表达水平以及检测IκB?α的降解；沉淀用细胞裂解液A洗1次，混悬于细胞裂解液B(细胞核裂解)，混匀后－20℃冷冻过夜，13000g离心15min，上清作为核蛋白提取物进行蛋白质印迹分析，用于分析NF?κB p65/Rel A亚基的转运入核。

    用Bradford法分别测定胞浆蛋白和核蛋白浓度。取胞浆蛋白40μg、核蛋白20μg，以8% SDS?PAGE凝胶电泳分离，电转移蛋白至PVDF膜，根据检测的蛋白采用不同封闭液封闭1～2h，加入一抗在室温孵育1h，漂洗一抗，加入二抗1h，漂洗二抗，暗室显影。

    1.7  统计学处理  实验数据以±s表示，采用SPSS11.0软件用t检验进行统计分析，P＜0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  EGb761抑制NO的合成  对照组细胞荧光强度很弱，表明NO生成的量很少，见图1A；经诱导组细胞荧光强度明显增强，表明产生了大量NO，见图1B；药物组见图1C。提示EGb761对于C6胶质瘤细胞中NO的合成具有显著抑制作用。

    同时应用Griess反应测定培养液中NO的含量。对照组细胞产生的NO含量很低，诱导组细胞产生大量NO，在一定时间范围内随诱导时间的延长而增多，而药物组C6细胞NO产量明显减少，两者差异有显著性（P＜0.01），见表1。表1  胶质瘤细胞的一氧化氮产量

    2.2  EGb761抑制iNOS的表达  为了揭示EGb761抑制C6胶质瘤细胞中NO合成的分子机制，用RT?PCR和蛋白质印迹分析分别从mRNA和蛋白水平检测了EGb761对iNOS基因表达的影响。结果表明：C6细胞经LPS和PMA诱导后，iNOS mRNA的表达量大大增加，而在加入LPS和PMA诱导前2h用EGb761预处理的C6细胞，则iNOS基因表达水平明显降低，以12h单独诱导为100%计，6h时为64.5%，用EGb761预处理细胞，则12h时为32.8%，6h时为21.6%，提示EGb761抑制了C6胶质瘤细胞iNOS的表达，见图2。用蛋白质印迹分析也可以观察到EGb761能显著地减少iNOS蛋白，以12h单独诱导为100%计，6h时为63.6%，用EGb761预处理细胞，则12h时为58.7%，6h时为23.6%，见图3。

    2.3  EGb761对NF?κB信号通路的影响  NF?κB信号通路是一个调控iNOS基因表达的关键信号通路， 在LPS和PMA诱导C6细胞表达iNOS基因的过程中伴随有NF?κB抑制蛋白IκB?α的降解， 以空白对照组为100%计， 单独诱导30min时为23.8%， 用EGb761预处理组则为76.5%。 同时可以检测到NF?κB p65/Rel A的转移入核， 以单独诱导30min为100%计， 空白对照组为8.6%， 用EGb761预处理组则为75.7%， 见图4， 提示在本实验条件下iNOS基因的表达依赖于NF?κB信号通路。

    3  讨论

    iNOS主要分布于吞噬细胞和胶质细胞中， 在细胞受到内毒素、 炎性细胞因子和氧化应激等因素的刺激下， 细胞内iNOS基因被诱导表达， 产生大量的NO， 并迅速与超氧阴离子反应， 生成具有强氧化性的过氧亚硝基， 对细胞产生毒副作用。 本研究以C6胶质瘤细胞为实验对象， 研究了LPS与PMA协同对C6细胞iNOS基因表达的诱导和EGb761的调控作用。 实验结果表明， LPS与PMA能协同诱导C6细胞iNOS基因的表达， 导致细胞产生高浓度的NO， 且具有一定的时间依赖性。 EGb761能明显地下调iNOS基因的表达， 减少C6细胞NO的生成。 结果提示EGb761对神经系统疾病的预防和作用可能与它能调控iNOS基因表达有关。

    iNOS基因的表达受到多种因素的调控。 目前研究认为这种调控主要发生在转录水平上。 iNOS基因启动子区域含有NF?κB结合元件、 AP?1结合元件以及肿瘤坏死因子反应元件等转录因子调控结合元件。 其中NF?κB的活化对胶质细胞、 巨噬细胞iNOS基因表达的调控作用尤为关键[8]。 NF?κB是一种普遍存在的转录因子， 在细胞中主要以p50/p65(RelA)二聚体形式存在， 其中p65亚基含有DNA活化域。 细胞处于静息状态时， 抑制蛋白IκB与p50/p65二聚体结合， p65亚基上的核定位信号(NLS)被IκB覆盖， 导致p50/p65二聚体不能进入细胞核内。 当NF?κB的诱导剂作用于细胞后， IκB被IκB激酶(IKK)磷酸化， 随后迅速被蛋白酶降解， 释放出“游离态”的p50/p65二聚体， p50/p65二聚体转移入细胞核引起基因表达[9]。 在这一信号通路中， IκB的磷酸化和降解步骤是NF?κB活化的关键步骤[8]。 NF?κB是一个对细胞氧化还原状态敏感的转录因子， 有研究表明NF?κB的激活可以被多种抗氧化剂抑制[10,11]。 在巨噬细胞中， EGb761可以通过抑制NF?κB信号通路而下调iNOS基因的表达[6]。 本研究利用蛋白印迹技术检测了EGb761对NF?κB信号通路活化过程中IκB?α的降解以及p65/RelA的转移入核的影响， 结果显示EGb761显著性抑制IκB?α的降解， 并且对p65/RelA的转移入核有一定的抑制作用， 说明EGb761通过调控NF?κB信号通路调控iNOS基因的表达。

【】
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