胃癌患者血清VEGF水平与T淋巴细胞嗜银蛋白含量的相关性及临床意义

               作者：杨进强，李勇，赵增仁，邝钢，范立侨，焦锟

【摘要】  目的 检测胃癌患者血清血管内皮生长因子(VEGF)水平和外周血T淋巴细胞嗜银蛋白(AgNORs)含量，探讨二者间的相关性及临床意义。方法 采用酶联免疫双抗夹心法(ELISA)定量检测74例胃癌患者和32例健康人血清VEGF水平，同时检测外周血T淋巴细胞嗜银蛋白含量并进行相关分析。结果 胃癌患者血清VEGF水平（383.33±121.67）pg/ml明显高于健康人（142.86±71.29）pg/ml（P＜0.01），其水平与肿瘤大小、浸润深度、分化程度、有无转移、TNM分期有关（P＜0.05或0.01）；而胃癌患者外周血T淋巴细胞Ag?NORs含量（4.30±1.21）%明显低于健康人（7.65±1.38）%（P＜0.01），其含量与胃癌分化程度、有无转移、TNM分期有关（P＜0.05或0.01）。胃癌患者血清VEGF水平与外周血T淋巴细胞嗜银蛋白含量呈显著负相关（r＝－0.659，P＜0.01）。结论 胃癌患者血清VEGF水平和外周血T淋巴细胞Ag?NORs含量是评估胃癌恶性生物学行为的重要指标。二者密切相关，对评价机体肿瘤免疫功能具有重要的临床价值。

【关键词】  胃肿瘤；血管内皮生长因子；T淋巴细胞嗜银蛋白；肿瘤免疫

    Clinical Implication and Relationship between Serum Level of Vascular Endothelial Growth Factor and Content of T Lymphocytes Ag?NORs in Gastric Carcinoma

        Key words：Gastric Neoplasm; VEGF; T Lymphocytes Ag?NORs; Tumor Immune

    目前，胃癌患者血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）与T淋巴细胞功能的关系尚未见报道。本实验通过检测胃癌患者血清VEGF水平和外周血T淋巴细胞嗜银蛋白含量（Argyrophilic?Nucleolar Organizer Regions, Ag?NORs），探讨二者间的相关性及临床意义。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料  全部74例胃癌患者均为2002年7月～2004年12月在河北医科大学第四外三科住院手术病人，均经胃镜检查、病理证实，术前未行放疗、化疗或应用免疫抑制及增强剂，无内分泌、血液系统疾患及肝、肾功能不良等合并症。其中男49例，女25例，年龄34～72岁，中位年龄62岁；按1985年UICC胃癌TNM分期标准，Ⅰ+Ⅱ期31例，Ⅲ+Ⅳ期43例；浸润深度T1＋T229例，T3＋T445例；高中分化腺癌26例，低分化腺癌48例。肿瘤<5cm 39例，≥5cm 35例；有转移58例(仅有淋巴结转移50例，合并有远处转移8例)，无转移16例。另有32例健康人为我院门诊体检成年人，男21例，女11例，年龄42～68岁，中位年龄58岁。

    1.2  检测方法

    1.2.1  血清VEGF水平的检测  体检健康人和入院后的胃癌患者晨起空腹采集外周静脉血2ml，静脉血混匀后于4℃3 000r/min离心10min，分离血清，-70℃保存。采用酶联免疫双抗夹心法(sandwish enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)定量检测血清VEGF水平，试剂盒由上海森雄科技有限公司生产，Biocell?2010型酶标仪由奥地利Anthos Labtec Instruments公司生产。检测过程严格按照操作说明书进行，酶标仪扫描结果，根据标准曲线求出VEGF浓度。

    1.2.2  外周血T淋巴细胞嗜银蛋白含量检测  体检健康人和入院后的胃癌患者晨起空腹无菌条件下静脉抽血0.5ml，加到含RPM1640培养瓶中，置37℃培养箱中72h。分离T淋巴细胞并低渗破膜后硝酸银染色，核仁呈淡黄色，Ag?NORs颗粒呈棕褐色，用KL?Ⅲ型肿瘤免疫图像分析系统（北京健尔康医疗设备有限公司），每例随机检测30个T淋巴细胞核仁银染面积比值（I.S％），取平均值作为检测结果。

    1.3  统计学处理  所有数据以±s表示，采用SPSS11.5统计软件进行方差分析和t检验，两变量间关系运用直线相关分析。检验水准α＝0.05。

    2  结果

    2.1  胃癌患者与健康人血清VEGF水平和外周血T淋巴细胞Ag?NORs含量

    胃癌患者血清VEGF水平较健康人明显升高，差异有统计学意义，P＜0.01；而外周血T淋巴细胞Ag?NORs含量较健康人显著降低，差异有统计学意义，P＜0.01，见表1。

    2.2  胃癌患者血清VEGF水平和外周血T淋巴细胞Ag?NORs含量与胃癌临床病理特征的关系，见表2。表1  胃癌患者与健康人血清VEGF水平和外周血T淋巴细胞Ag?NORs含量注：与健康人比较，▲P＜0.01表2  胃癌患者血清VEGF水平和外周血T淋巴细胞 Ag?NORs含量与胃癌临床病理特征的关系注：同一病理指标二者间比较，▲P＜0.01，△P＜0.052.3  胃癌患者血清VEGF水平和外周血T淋巴细胞Ag?NORs含量的关系

    对检测的74例胃癌患者血清VEGF水平和外周血T淋巴细胞Ag?NORs含量进行直线相关性分析，结果显示，两者呈显著负相关（r＝－0.659，P＜0.01)。

    3  讨论

    VEGF是一种多功能的细胞因子，可刺激肿瘤间质血管生成，抑制机体免疫功能，在肿瘤发生、、侵袭和转移过程中起重要作用。众多研究显示，胃癌细胞高表达VEGF，其水平与TNM分期、浸润深度、淋巴转移等指标密切相关，VEGF可作为判断胃癌恶性程度和预后的重要指标［1，2］。已有研究多采用免疫组化、原位杂交等方法，只能在肿瘤组织切除后进行，最近有学者［3］采用ELISA方法检测肿瘤患者术前血清中VEGF含量，结果表明术前血清VEGF可作为一种新的肿瘤标志物，对肿瘤诊断及预后判断具有重要的临床价值，且该方法具有无创、简便、可重复、能在肿瘤切除前进行等优点。Salven等［4］阐明血清VEGF可来源于肿瘤细胞的表达和分泌，并为血清VEGF的主要来源，而单核细胞、血小板则可能有储存及运输VEGF的功能。我们采用ELISA法检测胃癌患者与健康人血清中VEGF水平，结果显示胃癌患者较健康人VEGF水平明显升高(P＜0.01)，其水平与肿瘤大小、浸润深度、分化程度、有无转移、TNM分期等有关(P＜0.05或0.01)，VEGF可作为胃癌恶性生物学行为的血清学指标。

    肿瘤免疫实质上是细胞免疫，T淋巴细胞是机体参与抗肿瘤免疫应答的主要免疫活性细胞。观察肿瘤患者的T淋巴细胞免疫功能状态对分析肿瘤预后及疗效评估有重要的参考价值［5］。嗜银蛋白是核仁中可被银染的非组蛋白，它可以与组蛋白特异结合，解除组蛋白对核糖体基因（rDNA）转录的抑制作用，从而促进rDNA转录生成rRNA，而rRNA是构成核蛋白体的重要成分，保证蛋白质的合成顺利进行。T细胞核仁形成区嗜银蛋白的多少能反映细胞内蛋白合成及代谢活性变化，了解T淋巴细胞增殖活性。因此，监测外周血T淋巴细胞嗜银蛋白含量可准确反映T细胞免疫效力与机体细胞免疫功能［6］。本研究证实胃癌患者的外周血T淋巴细胞嗜银蛋白含量比正常人显著降低（P＜0.01），与胃癌分化程度、有无转移、TNM分期等有关（P＜0.05或0.01），表明胃癌患者细胞免疫功能缺陷，机体免疫监视和免疫清除功能障碍，在胃癌的发生、发展中起重要作用。

    研究发现造成肿瘤患者外周血T淋巴细胞免疫功能降低的原因是肿瘤细胞产生或分泌的一些免疫抑制因子，如IL?10、TGF?β1、VEGF等所致［7，8］，这些因子能广泛地抑制T淋巴细胞的分化与增殖，抑制杀伤性T淋巴细胞（TC）的抗肿瘤活性，诱导抑制性T淋巴细胞（TS）的产生，阻止辅助性T细胞的分化和成熟，使其数量减少，进一步影响其它免疫活性细胞的功能。有研究表明，胃癌细胞的VEGF表达与肿瘤组织中树突细胞(DC)、杀伤(NK)细胞密度负相关［9］，VEGF可以通过抑制DC、NK前体细胞的发育、成熟及其核因子(NF?κB)的活性来抑制DC和NK的功能［10］。最近Ohm等［11］研究发现向荷瘤动物胸腺和骨髓中注入重组VEGF，可显著抑制多能干细胞、淋巴系干细胞的迁移和分化，抑制T细胞的成熟和功能，提出VEGF干扰干细胞向T淋巴细胞分化是肿瘤免疫缺陷的可能机制。本研究结果发现胃癌患者血清VEGF水平和外周血T淋巴细胞Ag?NORs含量两者呈显著负相关（P＜0.01)，提示二者间存在紧密的内在联系，VEGF升高可能通过抑制外周血T淋巴细胞转录、增殖而影响机体免疫功能，其机制有待进一步研究。

    由此，我们认为胃癌患者血清VEGF水平和外周血T淋巴细胞Ag?NORs含量是评估胃癌恶性生物学行为的重要指标。二者密切相关，联合检测可能更有利于评价和判断机体肿瘤免疫功能状态，具有重要的临床参考价值。

【参考】
  ［1］ Feng CW, Wang LD, Jiao LH, et al. Expression of p53, inducible nitric oxide synthase and vascular endothelial growth factor in gastric precancerous and cancerous lesions: correlation with clinical features［J］. BMC Cancer, 2002, 2(1):8?11.

［2］Ohta M, Konno H, Tanaka T, et al. The significance of circulating vascular endothelial growth factor (VEGF) protein in gastric cancer ［J］. Cancer Lett, 2003, 192(2): 215?225.

［3］Karayiannakis AJ, Bolanaki H, Syrigos KN, et al. Serum vascular endothelial growth factor levels in pancreatic cancer patients correlate with advanced and metastatic disease and poor prognosis ［J］. Cancer Lett, 2003, 94(1): 119?124.

［4］ Salven P, Orpana A, Joensuu H, et al. Leukocytes and platelets of patients with cancer contain high levels of vascular endothelial growth factor ［J］. Clin Cancer Res, 1999, 5(3): 487?491.

［5］ 赵武述，陈述，卞志强. 临床免疫学［M］. 第1版. 北京: 人民卫生出版社，1994.162?172.

［6］ 刘广贤，孔宪涛，张婧，等. T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白在肿瘤诊断与监测中的价值［J］. 中华检验医学杂志, 2001, 24（3）：151?153.

［7］ Tsubono M, Nio Y, Shiraishi T, et al. Increased number of suppressor T?cells and impaired IL?2 mediated T?cell function in peripheral blood of gastric cancer patients［J］. J Clin Lab Immunol, 1990, 33(3):107?115.

［8］ D’Orazio TJ, Niederkorn JY. A novel role for TGF?βand IL?10 in the induction of immune privilege［J］. J Immunol, 1998, 160(5): 2089?2098.

［9］Yang L, Carbone DP. Tumor?host immune interactions and dendritic cell dysfunction［J］. Adv Cancer Res, 2004, 92: 13?27.

［10］Maehara Y, Tomisaki S, Oda S, et al. Lymph node metastasis and relation to tumor growth potential and local immune response in advanced gastric cancer ［J］. Int J Cancer, 1997, 74(2): 224?228.

［11］Ohm JE, Gabrilovich DI, Sempowski GD, et al. VEGF inhibits T?cell development and may contribute to tumor?induced immune suppression ［J］. Blood, 2003, 101(12): 4878?4886.