清肝开窍祛风法对电点燃模型大鼠c-fos蛋白表达的影响

【摘要】  　　目的 研究清肝开窍祛风法对电点燃癫痫大鼠模型的c-fos蛋白的影响。方法 将利用改良的Goddard方法造模成功的电点燃大鼠癫痫模型随机分为五组：模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、西药组。另取6只作为正常组，在造模成功后连续给予相应的药物28天后进行电刺激诱发癫痫，2h后取海马区脑组织用免疫组化法测定Fos蛋白。结果 免疫组化试验显示：大鼠电点燃癫痫模型大脑皮层、海马c-fos阳性细胞较正常组表达增强，密集分布，染色较深；而4个药物组则表达明显减少，分布稀疏，染色较浅。结论 清肝开窍祛风法能抑制Fos蛋白的表达，各剂量组与西药组疗效相当，但治疗组各指标均未完全恢复到正常对照组水平。

【关键词】  癫痫电点燃模型　清肝开窍祛风法　c-fos蛋白　细胞凋亡

　　　癫痫是神经科的常见疾病，据统计我国每年约有65～70万新发癫痫病人，全国共有癫痫病人超过600万,目前癫痫的治疗以药物为主，原有一线抗癫痫药物，仅可使80%的患者发作得以控制，并有明显的毒副作用，对行为、认知功能有负面影响，还存在不同程度的耐受性，新型二线抗癫痫药及手术疗法有其严格的适应证，费用高昂，临床疗效难以肯定。故我们在长期的临床基础上以清肝开窍祛风立法，采用经验方宁痫煎剂治疗癫痫，观察该药对电点燃模型大鼠c-fos蛋白的表达的影响，现如下。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  健康成年SD大鼠60只，雌雄各半，体重180～220g，由成都中医药大学实验动物中心提供（合格证号：川实动管质第9号）。

    1.2  试剂  用青黛、石菖蒲、全蝎（四川省医药公司提供）为方，经成都中医药大学附属药剂加工厂煎煮、回收挥发性成分、浓缩，制成每毫升含原生药1g。丙戊酸钠口服溶液（杭州赛诺菲德拉堡民生制药有限公司  H20041435）；戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司  WH20050411）；免疫组化试剂盒（北京莱博生物实验材料研究所目录号：LA0347）。

    1.3  大鼠电癫痫模型的复制  按照李昱［2］造模方法，制造电点燃模型癫痫大鼠，痫性行为评定根据Racine分级法［1］，大鼠出现4级及以上痫性行为（包括4级），并记录到AD即视为点燃［2］。

    1.4  动物分组  SD大鼠自由饮水和摄食1周后，选取体重230～300g大鼠造模，将造模成功的大鼠随机分为5组：模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组各8只，西药对照组6只。另选6只作为正常对照组。

    1.5  给药方法  模型复制成功后，观察大鼠行为，出现一次非诱发性的癫痫发作后开始给药，其中中药低剂量组为成人等效量的5倍［2.5g/（kg·d）］，中药中剂量组为成人等效剂量的10倍［5g/（kg·d）］，中药高剂量组为成人等效剂量的20倍［10g/（kg·d）］。西药组丙戊酸钠以人每天20mg/kg，换算成大鼠的剂量，每天2次灌胃。造模成功后按相应组别连续用药28天。

    1.6  观察内容及检测指标

    1.6.1  一般情况  分别观察各组大鼠造模前后及治疗前后的一半状态，包括体重、精神状态、活动情况等。

    1.6.2  Fos蛋白测定  治疗观察结束后再一次诱发癫痫，2h后6组全部取样。用4%多聚甲醛PBS缓冲液灌注大鼠，断头取脑，将鼠脑浸泡于4%多聚甲醛PBS缓冲液24h，取海马区层面进行脱水、透明及石蜡包埋，然后进行免疫组化检查。

    1.7  统计学方法      Fos蛋白表达、AD值和体重用SPSS统计软件11.5进行分析处理，采用单因素方差分析；行为观察大鼠的癫痫发作情况用Radit分析。

    2  结果

    2.1  一般情况  大鼠造模后，活动明显减少，进食进水量减少，蜷卧，时有湿狗样抖动，毛发直立、杂乱，体重下降（消瘦），1周后，活动较上周稍增加，但活动迟缓，时有呆立，饮食较前一周增多，体重无明显变化。给药组1周后毛发较前光整，精神状态好转，进食进水增加，活动增多，3周后活动自如，体重增加。

    2.2  Fos蛋白测定   大鼠电点燃癫痫模型大脑皮层、海马c-fos阳性细胞较正常组表达增强，密集分布，染色较深，多见褐色颗粒；而4个药物治疗组则表达明显减少，分布稀疏，染色较浅。见表1。表1  各组大鼠c-fos蛋白表达平均灰度的比较注：与模型组比较，▲▲P<0.01

    3  讨论

    中医认为本病的形成，大多由于先天因素、七情失调、饮食不节、劳累过度、头颅外伤、手术或虫体寄居，以及其他疾病之后，更有药害因素，造成肝、脾、肾等脏损伤，使脏腑功能失调，气机紊乱，痰浊阻滞，瘀血瘀阻，或风阳内动所致。

    《黄帝内经素问·卷二十一·六元正纪大论篇第七十一》曰：“木发之郁，太虚埃昏，云物以扰，大风乃至，屋发折木，木有变。故民病胃脘当心而痛，上支两胁，膈咽不通，饮食不下，甚则耳鸣眩转，目不识人，善暴僵仆”。《素问·至真要大论》病机十九条：“肝者中正之官，谋虑出焉；胆者将军之官，决断出焉”， 《寿世保元》还说“肝虚生风”，说明肝的升发太过与不及，分别导致阳升风动或虚风内动，风阳上扰或风动痰升，壅滞经络，闭塞清窍，便发为癫痫。肝气暴郁，魂不附体，则出现神志丧失，包括昏迷、失神（短暂意识丧失）、无自主运动（自动症）；肝气暴郁，引动肝风，肝过主筋则出现抽筋；肝开窍于目，今肝气暴郁，魂不附肝，目失所主则出现两目上翻或凝视；厥阴之气夹痰上逆则出现口吐涎沫；肝气暴郁,则出现尖叫。肝郁化火能引动肝风，惊恐郁怒，使心肝之气不舒，气郁生痰，痰被肝风所动，则上扰清窍。《古今医鉴·五痫》：“夫痫者……原解其由，或因七情之气郁结，或为六淫之邪所干，或因受大惊恐，神气不守，或年历幼受惊，感触而成，皆是痰迷心窍，如痴如愚，治之不必分五，俱宜豁痰顺气，清火平肝”。

    笔者于临床实践中运用清肝开窍法组方治疗癫痫，疗效较好，故特做此药的基础研究。

    本试验结果表明清肝开窍祛风法能有效地抑制癫痫大鼠脑内Fos 的表达。其机理可能包括两方面：本方中各组成中含有多种神经细胞抑制性成分，在功能上调节海马颗粒细胞的返回抑制中可能起重要作用，Ca2+内流受抑，直接或通过影响其他离子流而抑制神经元去极化，延缓了癫痫的发生，减轻发作强度，从而延缓或抑制了由痫性放电诱导的c-fos基因的表达;另一方面c-fos基因的表达受到钙离子的调控。触发电压依赖的钙离子内流的因素可诱导c-fos基因表达［3］，当神经元受刺激兴奋时，钙离子可经电压依赖的和受体门控的钙通道进入细胞，使神经细胞钙超载，钙离子与胞内钙调素结合，直接或间接启动c-fosmRNA转录［4］。

    清肝开窍祛风法通过抑制神经元兴奋，降低线粒体耗氧量等，缓解由于癫痫发作而引起的脑缺氧，钠泵作用及钙钠交换下降，钙内流，从而影响c-fos基因转录过程的激活，使神经细胞c-fos基因表达受到抑制。

    4  结论

    本试验采用电点燃方法，建立大鼠慢性癫痫模型，模仿人的癫痫发作过程，采用免疫组化法测定c-fos蛋白，评价宁痫颗粒对癫痫的疗效，研究清肝开窍祛风法对基因表达的影响，并初步探讨其机理。得出结论如下：（1） 采用改良的Goddard方法，能成功建立电点燃慢性癫痫模型，造模总成功率76%，点燃率97%，模型稳定，可控性好。（2）清肝开窍祛风法能有效减少癫痫的发作频度，降低其发作程度；提高后放电阈值，使癫痫大鼠脑电图好转；抑制Fos蛋白的表达各剂量组与西药组疗效相当，但治疗组各指标均未完全恢复到正常对照组水平。其作用机制可能与降低神经元的兴奋性，抑制钙离子内流，从而抑制c-fos蛋白表达等因素有关。

    【】
  1 Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II motor seizure. Electroenceph Clin Neurophysiol, 1972,32:281-294.

2 李昱.快速海马电点燃癫痫模型的改良方法.遵义医学院学报，2002, 25（2）:106-108.

3 Morgan J I,Cohen D R, Hempstead J L, et al. Mapping pattern of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science, 1987, 237（4811）:192-196.

4 Morgan J I, Curran T. Proto-oncogene transcription factors and epilepsy. TIPS, 1991, 12（3）:343-349.