清肺渗湿汤对哮喘大鼠肺组织淋巴细胞上凋亡调控基因Fas/Fas-L表达的影响

【摘要】  目的 观察清肺渗湿汤对哮喘大鼠肺组织淋巴细胞上凋亡调控基因Fas/FasL表达的影响。方法 将清洁级雄性Wistar大鼠60只随机分为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松组、清肺渗湿汤组、麻杏石甘加味汤组。以卵白蛋白致敏、激发的方式建立支气管哮喘急性发作期模型，各组分别给予相应，免疫组化ABC法检测肺组织中Fas/FaL-s的蛋白表达。结果 清肺渗湿汤、地塞米松片、麻杏石甘加味汤均能增强哮喘大鼠肺组织中淋巴细胞上促凋亡基因Fas/FaL-s的蛋白表达，与哮喘模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，清肺渗湿汤、地塞米松片效果显著，明显优于麻杏石甘加味汤组(P＜0.05)。结论 通过增强促凋亡基因Fas/Fas-L的蛋白表达而促进炎症局部淋巴细胞的凋亡是清肺渗湿汤减轻哮喘气道炎症反应一个主要机制。

【关键词】  清肺渗湿汤；肺；T淋巴细胞；哮喘；细胞凋亡；基因表达；膜糖蛋白类，生物合成；疾病模型，动物   
　　【Abstract】  objective  To observe the effect of Qingfeishenshi Decoction on gene expression of modulating apoptosis in lung lymphocyte of rat with asthma. Methods  60 rats were randomly divided into five groups, they were control group, asthma group, hexadrol group, Qingfeishenshi Decoction group and Mashingshigan decoction group. Bronchial asthma in acute episode model was established by a manner of egg albumen sensibilization and provocation. Rats in each group were treated by different drugs. Protein expressions of Fas/FaL-s in lung tissue were assayed by immune histochemistry. Results  Protein expression of Fas/FaL-s in lung tissue in hexadrol group, Qingfeishenshi Decoction group and Mashingshigan decoction group were potentialized, and were superior to those in control group (P<0.05). Protein expression of Fas/FaL-s in lung tissue in hexadrol group and Qingfeishenshi Decoction group were superior to those in Mashingshigan decoction group (P<0.05). Conclusions  Promoting apoptosis of local lymphocyte by potentiation of gene expression of Fas/FaL-s of modulating apoptosis was important mechanism of Qingfeishenshi Decoction, which can relieve inflammatory reaction of bronchial asthma.
   
　　【Key words】  Qingfeishenshi Decoction; Lung; T lymphocyte; Asthma; Apoptosis; Gene expression; Membrane glucoprotein; Biosynthesis; Disease Model; Animal

    “病热痰者当须渗利”是周兆山教授根据中医学“治病必求于本”思想提出的治疗支气管哮喘(热哮证)的创新性理念［1］，清肺渗湿汤是对这一理念的具体实践。清肺渗湿汤以麻杏石甘汤为基础，配合薏苡仁、茯苓、车前草、石韦等利水渗湿药，有宣肺化痰、渗湿利水之效。前期的临床研究已证实此方具有确切的临床效果［1］。我们通过观察清肺渗湿汤对哮喘大鼠肺组织淋巴细胞上Fas/Fas-L表达的影响，从细胞凋亡调控的角度探讨了清肺渗湿汤起效的分子生物学机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  实验动物 

　　60只清洁级健康雄性Wistar大鼠，体质量(200±20)g，月龄2～3个月，山东鲁抗医药集团有限公司提供(许可证号：SCXK鲁20050017)。

　　1.1.2  药物和试剂

　　1.1.2.1  药物 

　　地塞米松片(天津天药药业股份有限公司，药品批号：0504385)。麻杏石甘加味汤(药物组成：麻黄10 g，杏仁10 g，石膏30 g，炙甘草10 g，冬瓜仁30 g，蝉蜕12 g，浙贝母12 g，鱼腥草30 g)和清肺渗湿汤(药物组成：麻黄10 g，杏仁10 g，石膏30 g，炙甘草10 g，薏苡仁30 g，茯苓20 g，车前草10 g，冬瓜仁30 g，蝉蜕12 g，浙贝母12 g，鱼腥草30 g，石韦12 g)均由山东省青岛市中医制剂室制成灭菌浓煎密封制剂，使其生药含量分别为1.170、1.125 g/mL。

　　1.1.2.2  试剂 

　　卵白蛋白冻干粉10 g/支(Grade II，sigma A5253)，由华美生物工程公司上海分公司分装，批号：040402，配制成10%和1%溶液，过滤消毒后置4℃冰箱保存备用。一抗：Fas兔抗鼠多克隆抗体、Fas-L鼠抗鼠单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供；二抗：非生物素检测试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供；DAB显色剂由北京中山生物技术有限公司提供。

　　1.1.3  主要仪器 

　　超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备有限公司，标准号Q/3211812YQ007-2000)；Nikon YS100型光学显微镜；微量移液器(GILSON)；微量移液器吸头：20、200、1000 μL(GILSON)；1.5 mL微量离心管(eppendorf管，GILSON公司)；RAK-2001耐高温抗原修复盒(南京生物工程有限公司)；免疫组化孵育盒和PBS冲洗瓶(福州迈新公司)；PYX-DHS-X隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械厂)；Bs110型型天平(Sartorius公司)。

　　1.2  动物模型制备

　　实验大鼠随机分为5组，每组12只。分别为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松组、清肺渗湿汤组、麻杏石甘加味汤组。哮喘模型组和各药物干预组均于实验第1日、第8日和第15日共3 次在腹腔分2点注射10%卵白蛋白并0.9%氯化钠注射液致敏；第3次致敏1周后，每日以1%卵白蛋白并0.9%氯化钠注射液对模型组和药物干预组动物进行超声雾化吸入，诱发其哮喘发作，连续激发7日。正常对照组予0.9%氯化钠注射液代替抗原进行致敏和激发。

　　1.3  给药方法
 
　　5组均从激发阶段的第1日起开始给药，正常对照组和哮喘模型组均予0.9%氯化钠注射液灌胃30 g/kg；地塞米松组用地塞米松片1 mg/kg；其他2组分别予清肺渗湿汤和麻杏石甘加味汤灌胃30 g/kg。各组均连续给药7日。

　　1.4  标本的采集及免疫组化方法步骤 

　　心脏取血后处死动物，剥离肺脏，无菌操作下切取大鼠左侧肺组织，以4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，然后将石蜡切片进行脱蜡脱水、热修复、酶消化等处理，在此基础上分步骤滴加一抗、二抗工作液，并进行标记、染色和封片。

　　1.5  免疫组化评分标准 

　　肺组织淋巴细胞上Fas、Fas-L蛋白表达，阳性反应物质呈棕黄色，主要位于胞浆中，也可见细胞膜表达，Fas、Fas-L免疫组化染色的评分均采用Bresalier［2］的半定量公式。每张切片随机观察10个高倍视野(400×)，根据染色的强度分为阴性染色(0)、黄色染色(1)、棕黄色染色(2)和棕褐色染色(3)；分别每个视野中各染色强度分值与其在这个视野中所占百分比乘积之和，10个视野的平均值就是整张切片免疫组化染色定量结果。公式如下：IS=［(0×F0)+(1×F+)+(2×F++)+(3×F+++)］。(注：以不加一抗的切片为阴性对照)

　　1.6  统计学方法 

　　采用SPSS11.5 for Windows 统计软件包对数据资料进行统计处理，数据用均数±标准差(±s)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2  结  果

    大鼠肺组织淋巴细胞上Fas/Fas-L蛋白的表达见表1。表1  Fas、Fas-L阳性细胞表达分值（略）

    由表1可见，在大鼠肺组织中Fas-L蛋白的表达趋势与Fas一致。正常对照组大鼠肺组织淋巴细胞上Fas、Fas-L蛋白呈高表达，哮喘模型组大鼠肺组织的淋巴细胞上Fas、Fas-L蛋白呈低表达，与肺组织中淋巴细胞的数量呈负相关；地塞米松组、清肺渗湿汤组、麻杏石甘加味汤组肺组织淋巴细胞上Fas、Fas-L蛋白表达均高于哮喘模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明地塞米松、清肺渗湿汤、麻杏石甘加味汤均能提高哮喘大鼠肺组织淋巴细胞上Fas、Fas-L蛋白表达，而且这种增强Fas、Fas-L蛋白表达的作用尤以地塞米松组和清肺渗湿汤组明显(P＜0.05)。

　　3  讨  论

    近年来研究发现，淋巴细胞尤其是T淋巴细胞在哮喘发病中起关键作用。T淋巴细胞的活化及其产生的细胞因子可以调节肥大细胞和嗜酸性粒细胞的分化、成熟、聚集和炎症介质的释放，从而影响哮喘气道炎症的发生和气道高反应性［3］。T淋巴细胞凋亡减少可能是哮喘气道炎症持续存在的原因之一，因此促进T淋巴细胞的凋亡将有利于哮喘的。已有研究证实，淋巴细胞的凋亡受到凋亡相关基因及细胞内凋亡信号转导分子的调控，但对Fas介导的凋亡最为敏感。资料显示，T淋巴细胞Fas表达水平低下，Fas/Fas-L相互作用减弱，可导致T淋巴细胞凋亡障碍［4］。

    Fas抗原又称凋亡抗原-1(APO-1)，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)或神经生长因子受体(NGFR)家族成员，广泛分布于心、肝、肺、肾等器官，表达于多种细胞上，如淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞等。Fas介导的细胞凋亡需要天然配体(Fas-L)参与，Fas-L是40 ku的Ⅱ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)或神经生长因子(NGF)家族成员，与Fas分子结合后激活胞内Fas死亡信号序列的活性，从而诱导Fas细胞凋亡；因此有学者称Fas/Fas-L系统是介导细胞凋亡的重要信号转导通路之一［5］。本实验研究证实，各组大鼠肺组织中淋巴细胞上Fas蛋白的表达趋势与Fas-L蛋白相同，药物干预后地塞米松组和清肺渗湿汤组中Fas与Fas-L蛋白的高表达恰与这2组大鼠肺组织中淋巴细胞较高的凋亡率呈正向关系，因此证实了地塞米松组和清肺渗湿汤组之所以能诱导效应细胞的凋亡，与其提高促凋亡基因(Fas、Fas-L)的蛋白表达有直接关系。将此结果与前期病理显示的炎细胞浸润情况、肺组织中淋巴细胞的凋亡率进行纵向比较，可以推断出，清肺渗湿汤主要通过调控促凋亡基因(Fas、Fas-L)的蛋白表达，诱导了淋巴细胞的凋亡，从而减轻了其在病变局部的浸润。通过上述比较可以看出，清肺渗湿汤在治疗支气管哮喘时有着与糖皮质激素相似的抗炎作用，由此证明在传统处方麻杏石甘加味汤的基础上加用利水渗湿药能有效提高原处方的抗炎效果，进一步证实导师周兆山教授提出的治疗热哮证应本着“病热痰者当需渗利”原则不仅在临床上可行的，更有着经得起验证的分子生物学基础。

【】
  　　［1］周兆山,宋曦,张有花.清肺渗湿法治疗哮喘(热哮证)临床研究［J］.中医药学刊，2006,24(11):2002-2004

　　［2］Bresalier RS,Ho SB,Schoeppner HL,et al.Enhanced sialylation of mucin-associated carbohydrate structures in human colon cancer metastasis［J］.Gastroenterology,1996,110(5):1354-1367

　　［3］Durham SR,Till SJ,Corrigan CJ.T lymphocytes in asthma:bronchial versus peripheral responses［J］.J Allergy Clin Immunol,2000,106(5 suppl):S221-226

　　［4］Spinozzi F，Fizzotti M，Agea E，et al.Defective expression of Fas messenger RNA and Fas receptor on pulmonary T cells from patients with asthma［J］.Ann Intern Med,1998,128(5):363-369

　　［5］Matsumoto K,Schleimer RP,Saito H,et al.Induction of apoptosis in human osinophils by anti-Fas antibody treatment in vitro［J］.Blood,1995,86(4):1437-1443