大黄对重症急性胰腺炎大鼠肠道屏障功能保护的实验研究
【摘要】 目的 观察经空肠输注大黄煎液对重症急性胰腺炎大鼠肠道屏障功能的保护作用。方法 采用胰管逆行注射3.5%牛黄胆酸钠法建立大鼠重症急性胰腺炎(SAP)模型，假手术组用0.9%氯化钠注射液替代牛黄胆酸钠，所有大鼠均经胃造瘘口空肠置管。SAP组随机分为输注大黄煎液组(SAP?A组)及0.9%氯化钠注射液组(SAP?B组)2个亚组(每组12只)，假手术(SO)组8只。SAP造模成功48 h后，SAP组开始输注大黄煎液或0.9%氯化钠注射液。检测指标包括：肠道转运系数、血清淀粉酶、脏器细菌移位率、胰腺病理评分、血浆D?乳酸等。结果 ①SAP造模成功后72 h SAP?A组大鼠的肠道转运系数高于SAP?B组(P＜0.05)而低于SO组(P＜0.01)，脏器细菌移位率、血浆D?乳酸水平低于SAP?B组(P＜0.05)而高于SO组(P＜0.01)；②SAP?A组与SAP?B组在血淀粉酶和胰腺病理评分方面无显著性差异(P＞0.05)。结论 SAP早期经空肠输注大黄煎液有助于肠道功能的恢复和对肠道屏障功能的保护，但对SAP的病程、胰腺炎病情的影响不大。
【关键词】 重症胰腺炎 大黄 D?乳酸 肠道屏障功能 实验研究
【Abstract】 Objective To observe the effect of Rhubarb on the intestinal barrier of rats with severe acute pancreatitis (SAP).Methods SAP model of rats was induced by injecting adversely the 3.5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct, and saline was used in the rats of sham operation group instead of sodium taurocholate, and catheters were placed into the jejunum via gastrostomy for all rats. The 24 rats with SAP were randomly divided into two groups, group A(n=12) used Rhubarb decoction and group B used saline instead, and there were 8 rats in sham operation group. Rhubarb decoction was used after 48 hours of model making. The indexes observed were intestinal transmit index, bacterial translocation rate, serum amylase, histological score of the pancreas and the level of D lactate. Results Group A had a significantly higher intestinal transmit index, with a lower translocation organ bacterial rate and plasma D lactate, compared with that of group B (P<0.05). There was no difference in serum amylase and histological scores between the two groups (P>0.05).Conclusion The jejunal administration of rhubarb decoction can help to the restoration of intestinal function and the protection of intestinal barrier, but which can’t improve the state of SAP.
【Key words】 Severe pancreatitis;Rhubarb;D lactate;Intestinal barrier;Experimental study
急性胰腺炎是指消化酶被激活后对胰腺自身消化所引起的炎症，是一种较为常见的极为严重的急腹症［1］。中药大黄有助于肠功能的恢复，减少细菌内毒素的移位，保护屏障功能。本研究旨在通过动物实验，进一步评价大黄对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)肠道屏障功能的保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料 雄性Wistar大鼠32只，体重220～280 g，医学院上海实验动物中心提供；牛黄胆酸钠及D乳酸脱氢酶系Sigma公司产品；胰管插管采用内径为0.28 mm、外径为0.38 mm的聚乙烯管，系Becton Dickinson公司产品；L乳酸测定试剂盒为Randox公司产品；生大黄煎液由本院药剂科配制，浓度为10 g/100 ml。
1.2 主要仪器 微量注射泵，Heraeus低温高速离心机，日立7170S自动分析仪。
1.3 实验设计 32只大鼠采用抽签法随机分为3组，SAP?A组12只滴注大黄煎液；SAP?B组12只滴注0.9%氯化钠注射液；假手术(SO)组8只。造模成功后48 h，分别予以大黄煎液或0.9%氯化钠注射液。大黄煎液浓度为10 g/100 ml，速度为5 ml/h，每8 h 1次，每次2.5 ml，共3次。
1.4 模型制作 造模前大鼠禁食12 h，自由饮水。采用胰管逆行注射法造模，先在十二指肠乳头部系膜对侧缘以412号针头对准乳头方向穿刺并进入胆胰管，使出现一隧道，然后拔出针头，小心从同一部位、沿同一路线插入细聚乙烯管，没入胆胰管开口处约1 cm，在十二指肠壁绕聚乙烯管以6?0线缝合1针，防止牛黄胆酸钠注射时向十二指肠肠腔反流，在左右肝管汇合处以小动脉夹夹闭以防止向肝脏方向反流，用微量注射泵按3 ml/h速度匀速向胰管注入3.5%牛黄胆酸钠(0.2 ml/100 g)，注射后维持5 min，观察到胰腺有病变时方可录用。空肠置管：经胃幽门区，避开血管丰富区，先用粗针戳一破口，然后置入一外径1.5 mm(内径1.0 mm)的硅胶管，远端位于空肠屈氏韧带以下5 cm左右，缝合固定，经皮下隧道将硅胶管自颈部引出，导管穿过弹簧，用自制背扣固定于颈部皮肤。关腹后，于大鼠后大腿内侧皮下注入0.9%氯化钠注射液20 ml/kg。假手术组用0.9%氯化钠注射液替代牛黄胆酸钠。
1.5 观测指标及方法
1.5.1 肠道转运功能 测量幽门至兰染距离与整个小肠长度比(幽门至回盲部)，反映肠道转运功能情况，用百分数表示为转运系数。
1.5.2 血清淀粉酶 采用碘比色法测血清淀粉酶含量。
1.5.3 生物屏障 肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)、肝及脾组织牛肉汤中增菌18 h后，再接种于血平板培养基中，培养出细菌之脏器为阳性脏器，最后各实验组脏器细菌移位率(细菌培养阳性脏器数/培养脏器总数)。
1.5.4 胰腺病理观察 胰头处胰组织常规固定、包埋、HE染色制片，采用Kusske法［2］进行病理评分。
1.5.5 机械屏障 血浆D?乳酸采用改良的酶学分光光度法检测［3，4］，按Randox L?乳酸测定试剂盒说明书步骤配置酶试剂缓冲液，酶试剂缓冲液Ⅰ号中只加入L?乳酸脱氢酶，酶试剂缓冲液Ⅱ号中则同时加入L?乳酸脱氢酶和D?乳酸脱氢酶，然后分别用Ⅰ、Ⅱ号酶试剂缓冲液2次测定血浆标本中L?乳酸量，2次结果之差即为血浆标本中D?乳酸含量(550 nm处测定吸光度)。基本反应式是乳酸脱下的氢生成H2O2，后者在过氧化物酶催化下与4?氨基安替比林及N?乙基?N?(2?氢?3?磺丙基)?间?甲苯胺生成紫色产物。
1.6 取标本步骤及保存方法 造模成功后72 h，自鼠胃中注入50% Evan blue染料0.5 ml，30 min后麻醉大鼠，进腹记录腹腔内各脏器情况，标记染料终末端；下腔静脉取血(检测淀粉酶、D乳酸)，血分2种：加抗凝剂EDTA 4 ml，未加抗凝剂2 ml；快速切取回肠系膜淋巴结3枚及肝、脾组织各0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，分别切碎后置入牛肉汤中增菌；胰头组织标本0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm置入10%甲醛液中固定。血标本低温离心20 min(4 ℃，1 500 r/min)，血清、血浆标本分装后置于-70 ℃冰箱中保存待测。
1.7 统计学处理 所有实验结果以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 10.0统计软件包作ANOVA方差分析及χ2检验，P＜0.05为统计学有显著性差异。
2 结 果
2.1 大体标本(术中所见) 假手术组腹腔未见异常；SAP组胰腺有不同程度水肿、坏死，伴肠系膜、后腹膜皂化斑和血性腹水。
2.2 肠道转运功能 肠道转运系数反应肠道蠕动功能恢复情况。SAP组较假手术组肠道转运系数低(P＜0.01)；SAP?A组较SAP?B组肠道转运系数高(P＜0.05)。见表1。
2.3 血淀粉酶 大鼠重症急性胰腺炎时淀粉酶急剧升高，72 h时仍维持在较高水平，SAP组组内差别不显著，而SAP组与假手术组间差异显著，前者是后者的3倍(P＜0.01)。见表1。表1 3组检测指标比较与SO组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与SAPB组比较，#P＜0.05，△P＞0.05
2.4 脏器细菌移位率 正常动物仅在MLN中，假手术组偶在MLN和肝中培养出细菌，检出细菌95%以上是G?肠道杆菌，本实验检出细菌主要为大肠杆菌，其次是绿脓杆菌和鼠粪肠球菌。表1中看出，SAP组较假手术组脏器细菌移位率高(P＜0.01)；SAP?A组与SAP?B组比较，差别亦有统计学意义(P＜0.05)。
2.5 病理改变 光镜下假手术组无明显变化，SAP组胰腺间质和胰小叶大量炎症细胞浸润、出血及大片坏死。表1中看出病理总分胰腺炎组组内无显著性差异(P＞0.05)，而胰腺炎组与假手术组间有显著性差异(P＜0.05)。
2.6 血浆D?乳酸变化 假手术组血浆D?乳酸为0.08 mmol/L左右，SAP组血浆D?乳酸则升高明显，SAP组与假手术组比较有极显著性差异(P＜0.01)；SAP?A组与SAP?B组比较亦有统计学意义(P＜0.05)。
3 讨 论
急性胰腺炎是一种严重的急腹症，中医学虽无胰腺炎的病名，但对其症状和体征却早有类似描述，“按之心下满痛者，此为实也”(《金匮要略》)，“从心下至少腹硬满而痛不可近者”(《伤寒论》)，治法“当下之”(《金匮要略》)。中医学用大黄胰腺炎悠久，大黄主攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒。药理和动物实验研究还表明大黄能抑制胰蛋白酶等多种胰酶，缓解急性胰腺炎的能量代谢障碍，改善胰腺炎早期的胰缺血，增加胰腺组织DNA合成和蛋白含量，参与胰腺细胞的修复和再塑，对胰腺细胞具有保护作用［5］。大黄治疗胰腺炎充分体现了中医学以攻为补，推陈致新的辨证思想。
本研究在前人的基础上，进行了3个改进：①模型制备方面的改良，采用细针穿刺和细管留置的各自优点，先用细针进行穿刺，再插留置管，既缩短了时间，又提高了成功率；②经空肠置管输注大黄煎液，方法简便，而且紧密结合临床实际，而既往的研究多采用经胃管直接推注大黄煎液，不符合生理，因为此时的胃往往潴留严重，本研究中即发现SAP大鼠72 h时的胃体积是正常大鼠的2倍左右；③D?乳酸检测方法的应用及改良。D?乳酸是细菌代谢、裂解的产物，肠道菌群中多种细菌均可产生，通常情况下，血中D?乳酸水平很低；而哺乳动物组织既不产生D?乳酸，也不能或仅能缓慢代谢D?乳酸。这样，血中D?乳酸的蓄积可能反映全身感染或某些胃肠道疾病时肠黏膜通透性的增高［8］。所以，D?乳酸水平实际上是反映了肠道屏障功能情况。国内亦有报道，认为D?乳酸可作为新的血浆标志物应用于急性肠黏膜损害的早期诊断［9］。近几年来，已陆续有将D?乳酸用于评价肠道屏障功能方面的报道。本研究对原有的D?乳酸检测方法进行了改进，运用了先进的全自动生化分析仪，只需很少的血标本量即可检测；同时利用D?乳酸脱氢酶与L?乳酸脱氢酶互相不能催化对方底物、吸光度可以进行叠加的原理，分2次检测L?乳酸量，二者差即为D?乳酸量。
重症急性胰腺炎早期即存在肠道细菌和内毒素的移位，这是胰腺炎继发感染的主要细菌来源。大黄能减少细菌和内毒素的移位，保护肠道屏障功能。其机理可能有以下几个方面：①大黄本身对多种阳性菌、阴性菌及肠道内的厌氧菌有抑制作用，能显著降低血浆及肠道内毒素水平；②大黄对结肠的电活动有明显的兴奋作用，使收缩活动增强，并阻止结肠内水分吸收，加快结肠内容物的排出；③大黄能降低血管的通透性，改善血管的脆性，提高血浆渗透压，降低血液的高黏度，达到扩容及改善肠道微循环的目的。本实验发现SAP组中大黄输注组大鼠的肠道转运系数高于0.9%氯化钠注射液组，而脏器细菌移位率、血浆D?乳酸水平低于0.9%氯化钠注射液组，且均有统计学差异(P＜0.05)。这2个结论再次证实了大黄在抑制细菌和内毒素的移位、促进肠蠕动、保护肠道屏障功能方面的作用。
本实验未发现大黄输注组与0.9%氯化钠注射液组在血清淀粉酶和胰腺病理评分方面的差异，说明短期使用大黄输注并不能改变胰腺炎的病情严重程度，对胰腺炎病程的影响不是很明显。
总之，SAP早期经空肠输注大黄煎液对肠道功能的恢复、肠道屏障功能的保护作用是很明显的，但对SAP的病程、胰腺炎病情的影响不大。
【文献】
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