骨肉瘤基因表达与化疗疗效的相关性研究进展
【关键词】 细胞周期
骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于10～20岁的青少年，预后差。从上世纪70年代开始，化疗药物开始应用于骨肉瘤的，取得了显著的临床疗效。近年随着肿瘤分子生物学研究的进展，人们已认识到骨肉瘤的基因表达不但决定骨肉瘤的发生、和预后，而且也影响了骨肉瘤的化疗疗效。但有关骨肉瘤的基因表达与化疗疗效的相关性研究尚属起步阶段，对它们之间内在关联性的认识尚不深入，现将有关这方面的研究概况作一综述。
1细胞周期调控基因的状态与化疗疗效的预测
细胞周期是细胞完成增殖的过程，可通过不同的基因来控制。其中细胞周期中有2个基本调控点，即G1／S限定点和G2／M限定点。前者决定细胞能否进入细胞周期，后者决定细胞进入M期完成有丝分裂。研究表明一些基因及其产物如p53基因、细胞分裂周期基因和细胞周期素基因是细胞周期调控中的重要调控因子，尤其在对G1／S限定点调控中起重要作用；当化疗药物直接或间接损伤DNA后，可启动程序性死亡过程引起细胞的死亡，使化疗有效；相反细胞也可通过修复机理，恢复正常状态使化疗无效；细胞这种对化疗不同的反应取决于调节G1／S限定点和G2／M限定点基因功能状态，因而肿瘤细胞周期调控基因的状态与化疗疗效之间存在着必然的联系，影响着化疗的效果。
11细胞周期素依赖激酶(cyclin dependent kinases,CDK）
细胞周期素依赖激酶(cyclin dependet kinases CDK）是细胞周期调控的中心环节，分为CDKl(CDC2）、CDK2～CDK7，CDK分别受到细胞周期素(cyclin）的正调控和细胞周期素依赖抑制蛋白(CKI）的负调控。在稳定的条件下，细胞增殖周期是由不同的CDK在G1／S和G2／M 2个限制点(restriction point）进行自控性调节。CDK可被正调节信号即cyclin活化，活化后可以使底物Rb蛋白磷酸化，使其抑制细胞增殖作用丧失〔1〕。当G1／S和G1／S的关键限制点失控，就有可能使本应停止增殖或生理性凋亡的细胞不停地进入细胞周期，从而导致恶性增生。Ragazzini等〔2〕的研究结果显示CDK4蛋白在20例低分化的骨肉瘤中强表达，表达率为65％。Benassi〔3〕等研究了39例骨肉瘤中pRb／p16／CDK4的表达情况，发现CDK4过表达的患者除预后差以外，也影响化疗疗效：CDK4过表达的病人其化疗疗效比低表达的病人差。
12细胞周期素(cyclin）
细胞周期素(cyclin）为重要的细胞周期蛋白的调控基因，其表达产物能激活CDK的活性，使其底物Rb蛋白磷酸化，造成细胞周期调节失控、肿瘤形成。目前发现的cyclin有cyclin A～H。cyclin A～B主要出现于G2／M期，cyclin C、D、E主要出现于G1／S期，cyclinD在G1期中晚期发挥重要作用，cyclin E在G1／S交界处达到高峰〔1〕。目前有关cyclin D1对化疗疗效的预测作用是研究的热点。人类恶性肿瘤中，Cyclin D1常常出现过度表达，通过CDK4的作用导致肿瘤的发生发展，常作为预测疗效的指标，CyclinD1过表达的患者化疗疗效差〔4、5、6〕。Benassi等用免疫组化技术和蛋白质印迹法证实Cyclin D1是预测骨肉瘤预后的有价值指标〔9〕。而Maitra等用免疫组化技术研究表明在38名儿童骨肉瘤患者中，未发现Cyclin D1过表达〔7〕。Molendini等通过对92个骨肉瘤标本免疫组化染色，未发现Cyclin D1过表达，反而发现Cyclin D1低表达者，发生转移的几率高，预后差〔8〕。Ewen等发现将野生型Rb与Cyclin D1共同导入Rb基因缺失的骨肉瘤细胞株SAOS2中，没有发现Rb的过磷酸化，而将Rb与Cyclin D2导入SAOS2中，可发现Rb过磷酸化，使Rb对细胞生长的抑制效应失活，提示骨肉瘤中Cyclin D的作用是不相同的〔8〕。Cyclin D在骨肉瘤中的表达及其与化疗疗效的关系，有待于进一步的研究。除了Cyclin D以外，Molendini等〔8〕研究发现Cyclin A和Cyclin E在骨肉瘤细胞中高表达，并发现Cyclin A阳性表达率越高化疗后的复发率也越高，表明Cyclin A的表达与骨肉瘤的化疗疗效呈负相关。
13p53基因
p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。定位于17p13，野生型p53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性繁殖中起重要作用。研究发现，p53突变参与细胞周期调控和DNA修复等多个过程的改变，是肿瘤发生的中心环节。在调控细胞周期方面，野生型p53主要是通过转活基因编码p21WAFl蛋白，p21WAFl可以抑制cyclin D／CDK4或CDK6以及cyclin E／CDK2的活性，从而减少Rb蛋白的磷酸化，阻止细胞通过G1／S限定点，抑制细胞增殖。突变的p53由于结构的改变影响转录活化功能或p53蛋白磷酸化过程，引起p53抑制细胞循环的功能丧失，这样就不仅失去了野生型p53对肿瘤的抑制作用，而且又具有了癌基因的功能〔1〕。尽管骨肉瘤p53蛋白表达与化疗疗效的关系已有研究，但结论尚有差异。Papal等〔10〕用免疫组化的方法研究了21例化疗前后的骨肉瘤标本，发现5例p53阳性表达的骨肉瘤患者在1 a内死亡，而阴性表达者(11例）均存活，平均随访35 a。并且所有化疗前p53表达阳性的患者，对化疗都没有反应。提示p53高表达是预测骨肉瘤化疗疗效的指标。但是Pakos等〔11〕对16组(共499位患者）有关TP53与骨肉瘤预后及化疗关系的研究行meta分析，结果发现TP53基因的状态与骨肉瘤的化疗疗效之间无关联。最近的研究也表明TP53基因的状态不能预测骨肉瘤的化疗疗效〔12〕。因此尽管骨肉瘤中存在p53基因的突变，但是p53基因的状态是否可以反映骨肉瘤的化疗疗效尚有待进一步探讨。
14MDM2基因
MDM2基因，位于染色体12q1314，其编码产物为9425ku，是一种p53结合蛋白。扩增的MDM2基因能摆脱p53基因的生长调控作用，且与p53蛋白结合使p53功能失活。在人类许多肿瘤中，如软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性胶质细胞瘤及一些乳腺肿瘤中，都有MDM2基因的扩增和MDM2蛋白产物的过量表达。Ladanyi等〔13〕研究了28例骨肉瘤，16例原发性骨肉瘤未发现MDM2基因扩增，而12例转移或复发性骨肉瘤中有4例MDM2扩增。Yokoyama等〔14〕研究表明虽然MDM2基因扩增或过表达与骨肉瘤侵袭和转移存在相关性，但是MDM2基因扩增与骨肉瘤化疗疗效之间无关联。
2骨肉瘤细胞增殖活性与化疗疗效的预测
肿瘤与正常组织的区别在于其细胞的无限制性生长。肿瘤生长越快，其恶性程度越高，所以肿瘤细胞增殖活性的测定在一定程度上反映了肿瘤的生物学行为，化疗如果有效则骨肉瘤细胞的增殖活性就会降低，通过测定骨肉瘤细胞的增殖活性，可以反映其化疗疗效。
增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是1978年Miyachi等在系统性红斑狼疮患者的血清中发现并提纯的一种自身抗原。PCNA合成并存在于细胞核内，是一种细胞周期调节蛋白，常作为测定细胞增殖水平的指标，其在细胞核内阳性表达的高低与细胞增殖活性密切相关。测定化疗前后肿瘤细胞PCNA的表达，可以对化疗效果作出评价，Nakashima等〔15〕用免疫组化的方法检测26例骨肉瘤标本，结果示PCNA的阳性率为808％，并指出PCNA能较好地反映骨肉瘤组织的增殖能力，通过检测PCNA在化疗前后骨肉瘤组织中的变化，能预测术前化疗的疗效。
3多药耐药(MDR）与化疗疗效的预测
多药耐药(multidrug resistance,MDR）是骨肉瘤化疗失败的主要原因，它是指肿瘤细胞产生的一种特殊的耐药现象，其特点是细胞一旦对某种药物产生耐药，同时对其他结构和作用机理不同的药物产生交叉耐药现象。MDR表型的基因包括：MDR、MRP、肺耐药蛋白LRP、谷胱甘肽S转移酶(GST）、拓扑异构酶H(Topoll）等。目前已有不少有关MDR基因的表达与化疗疗效相关性的研究报道，其中以细胞膜糖蛋白(Pgp）研究的更为广泛。多数学者认为人骨肉瘤细胞中Pgp的过度表达与骨肉瘤的预后不良有关，但与化疗疗效的相关性研究较少。Jay等〔16〕用RTPCR的方法在对22例化疗前后同一患者的标本研究中发现，化疗后MDRI的表达比化疗前明显增高，证明了化疗药物的应用可以诱导肿瘤细胞产生多药耐药性的产生，造成化疗失败。研究MDR表型基因的表达状态与骨肉瘤化疗疗效的相关性对于改善临床治疗疗效是非常有意义的。
4热休克蛋白
热休克蛋白(HSP）是一组具有重要生理功能、高度保守的蛋白质分子，普遍存在于生物细胞中，应激状态下被诱导表达，故又称为应激蛋白。肿瘤形成过程中，肿瘤细胞不断增殖，合成代谢增强，需要大量的HSP来调节和稳定这一异常增殖过程。正常细胞中，HSP的表达受细胞周期调控，而肿瘤细胞中突变或异常蛋白质的存在刺激HSP的合成，使其呈现持续的高诱导表达。HSP的高表达增强了肿瘤抗凋亡能力，使细胞的生长抑制效应和死亡减弱〔17〕。Trieb等〔18〕发现，HSP60在良、恶性骨肿瘤的细胞质中均有表达，但HSP72在骨肉瘤细胞核中的表达量明显多于其他非恶性肿瘤，HSP72阳性的骨肉瘤患者对新辅助化疗更具敏感性。因此，HSP72是预测骨肉瘤对新辅助化疗应答与否的一个重要免疫组化指标。至于HSP90，现在的研究认为抗HSP90抗体的存在与骨肉瘤对新辅助化疗的组织学应答良好有关，而抗体缺如则与肿瘤发生转移有关〔19〕。所以抗HSP90抗体在预测骨肉瘤化疗疗效方面亦具有临床研究价值。
尽管上述研究表明骨肉瘤的肿瘤基因表达与化疗疗效之间有一定的相关性，但由于研究样本量少，选择的生物学指标分散，结果尚不完全一致，至今研究结果未证实一种有特异的基因表达用于预测骨肉瘤化疗的疗效。相信随着对肿瘤分子生物学的深入研究，样本量的不断扩大，必将发现特异的基因表达与骨肉瘤化疗疗效相关性，指导骨肉瘤的临床化疗；同时发现影响骨肉瘤化疗疗效的主要基因，采用相关技术，达到增强或抑制该基因的表达目的，提高骨肉瘤的化疗疗效，改善临床结果。
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