针对人caspase?8基因的siRNA的载体的构建及其表达

 【摘要】  目的 构建针对人caspase?8 基因mRNA的siRNA表达载体，并观察其对转染细胞中caspase8的抑制作用。方法 化学合成针对caspase?8发夹状的RNA寡核苷酸，将其退火形成双链，连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞，RT?PCR测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果。结果 成功地构建了针对人caspase?8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER?C1和pSUPER?C2，并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase8基因的干涉作用，而且pSUPER?C1对于caspase?8基因的抑制作用要优于pSUPER?C2。结论 成功地构建了针对人caspase?8基因的siRNA载体，转染HeLa细胞后可抑制caspase?8基因的表达。

【关键词】  caspase8；RNA干涉；真核表达载体；HeLa细胞

    Abstract:Objective  To construct the eukaryotic expression vector for RNA interferencing human caspase?8 gene and detect its interference effect HeLa cell line. Methods  Two target gene segments were synthesized and cloned into pSUPER vector respectively to construct two recombinant eukaryotic expression vectors：pSUPER?C1 and pSUPER?C2．The two recombinant vectors were identified by enzyme digestion analysis and DNA sequencing Then HeLa cells were transfected with pSUPER?C1 or pSUPER?C2， the interference effect was detected by RT?PCR. Results  Enzyme digestion analysis and DNA sequencing showed that the target segments were cloned into pSUPER vector respectively．The results of RT?PCR indicated that both vectors could knock down the transcription and expression of caspase gene，and that pSUPER?C1 had better interference effect than pSUPER?CS2. Conclusion  The transcription and expression of caspase?8 gene were inhibited effectively by the constructed RNAi eukaryotic expression vectors in the HeLa cells.

    Key words:caspase?8；RNA interference；eukaryotic expression vector；HeLa cells

    细胞凋亡(apoptosis)是细胞在受到生理或病理刺激后发生的自发性、无炎症的死亡过程。 近年研究表明，在众多的凋亡相关蛋白中，caspase是细胞凋亡的关键执行者［1］。caspase即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific protease，caspase)，是一类进化上高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族。caspase?8 全长有479个氨基酸， 在Fas、TNFR?1、DR4、DR5等死亡受体介导的细胞凋亡中，caspase?8  经“诱导接近模式”活化，活化的caspase?8 激活下游效应caspase，如caspase?3、?6、?7等，诱发细胞凋亡［2?4］。

    RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由双链RNA引发的转录后基因沉默现象，这一机制能够特异性地降低目的基因的表达，是生物体内普遍存在的生理现象。通过对这一现象的深入研究，从利用体外合成双链RNA，到通过质粒稳定表达能够回折成为RNA诱发RNA干扰，这一技术被不断完善，并广泛用于基因功能和基因研究［5］。我们设计并构建caspase?8靶向的发夹状siRNA，并探讨这种载体对caspase?8基因表达的抑制作用。

    1  材料与方法

    1.1  材  料

    RNAi的真核表达载体pSUPER、neo的真核表达载体购自oligoengine公司，pCDNA3及人宫颈癌细胞系HeLa均由本室保存；限制性内切酶EcoR I、Hind Ⅲ、BglⅡ、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶为Promega公司产品。逆转录试剂盒、Trizol RNA分离试剂、Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品；RPMI?1640、G418均购自GIBCO公司；caspase?8鼠抗人IgG为abcam公司产品；Cy3标记的山羊抗鼠二抗购自博士德公司。

    1.2  针对caspase?8基因的寡核苷酸的设计和制备

    根据Genbank中caspase?8基因的序列，在编码区内选择2段19 nt(分别位于基因序列中188～207和1168～1187)为不同的干涉区域，分别进行BLAST比较，以避免与其它基因同源。根据RNA干涉载体pSUPER的要求，每段各设计一对长64个碱基的序列，由北京奥科生物公司合成。序列如下：5′?GAT CCGGAGCTGCTCTTCCGAATTTTCAAGAGAAATTCG

    GAAGAGCAGCTCCTTTTTTGGAAA?3′，互补链为5′?A GCTTTTCCAAAAAAGGAGCTGCTCTTCCGAATTTCTC TTGAAAATTCGGAAGAGCAGCTCCG?3′； 5′?GATCCC GAGATATATCCCGGATGATTCAAGAGATCATCCGGG ATATATCTCGTTTTTTGGAAA?3′，互补链为5′?AGCTT TTCCAAAAAACGAGATATATCCCGGATGATCTCTTG AATCATCCGGGATATATCTCGG?3′，划线部分为siRNA引物序列，两端包含Hind Ⅲ和BglⅡ的识别位点。

    1.3  构建siRNA的pSUPER表达载体

    用HindⅢ和BglⅡ双酶切pSUPER载体，37℃、3 h、1％琼脂糖凝胶电泳后，回收载体大片段(上海华舜公司试剂盒)；将合成的互补链分别退火，形成带有黏端的双链，用T4连接酶分别连接入pSUPER载体中Hind Ⅲ和BglⅡ的酶切位点之间。转化大肠杆菌DH5，挑选Amp抗性克隆，培养并制备质粒，用EcoR I、Hind Ⅲ双酶切(因BglⅡ酶切位点已不存在)鉴定。酶切鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序，将测序正确的克隆分别命名为pSUPER?C1和pSUPER?C2。

  

  1.4  脂质体介导的HeLa细胞的稳定转染

    在6孔板内按每孔1×106细胞接种细胞，第2天2个重组质粒及pSUPER载体质粒分别与pcDNA3载体质粒按10∶1的浓度共转染HeLa细胞，操作步骤按Lipofectamine 2000说明书进行。转染48 h后换为含400 ml G418的选择培养基继续培养，10～15 d后获得3种质粒，分别与pCDNA3质粒共转染后的HeLa细胞稳定克隆。

    1.5  caspase?8基因表达的RT?PCR检测

    从mRNA水平检测caspase?8的表达。分别收集3种共转染后的HeLa细胞和未转染的HeLa细胞各5×106，采用Trizol RNA分离试剂提取细胞的RNA。取5 μg总RNA，加入1 μg的oligo(dT)12?18(0．5 μg/μl)，按照Super?ScriptⅡ RT逆转录试剂盒产品说明书操作，合成cDNA第1链。PCR引物由primer 5.0软件设计(基因序列中144～1192，片段长958 bp，包含了2个干涉区域)，上游引物为5′?CCAGGAAAAGAGAATGTTGGAGGAA?3′，下游引物为3′?TGCTCTATATAGGGCCTACTCCGAC?5′。取2μl逆转录产物作为模板。反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，30个循环后于72℃延伸7 min。并以β?actin为内参照，各取10 μl反应产物，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

    2  结  果

    2.1  对caspase?8基因干涉载体的构建

    将筛选到的pSUPER?C1、pSUPER?C2质粒小量快速提取后，用限制性内切酶EcoR I/Hind Ⅲ双酶切鉴定，切成2 949 bp的大片段和291 bp的小片段，证明插入片段和载体的大小均正确。将菌种送北京奥科生物公司测序，结果完全正确，证实干涉载体构建成功(图1)。

    2.2  转染重组质粒的细胞中caspase?8基因的表达

    用上述重组的pSUPER载体及空载体分别转染人HeLa细胞，转染细胞挑克隆，经RT?PCR产物电泳显示，转染pSUPER?C1及pSUPER?C2的HeLa细胞中caspase?8基因的mRNA水平明显降低,并且转染pSUPER?C1对caspase?8基因的mRNA水平的降低更明显；内参照β?actin的mRNA不受影响(图2)。

    3  讨  论

    RNAi现象自从1998年被发现以来，一直是生命的研究热点，并且逐渐成为研究基因功能的重要工具。产生siRNA的方法有多种，但是采用siRNA表达载体产生siRNA具有简便、快速、成本低等优点，因而siRNA表达载体的出现极大的促进了RNAi技术的应用。本研究使用pSUPER作为产生siRNA的载体，其优势在于它具有H1Ⅲ型聚合酶启动子，能够精确高效地转录出发卡夹状RNA，进而在体内被切割成可以发挥RNA干扰效应的siRNA。由于pSUPER RNAi系统的高效性和特异性，该系统以及功能广泛用于基因表达调节的研究［6］。

    凋亡启动亚类以caspase?8为代表，包括caspase?2、?8、?9和?10，其前体分子N端具有长的原结构域，其中含有DED或CARD结构域，在介导caspase与胞浆接头蛋白（adaptor）的连接上起作用。这类分子具有与DR胞质区结合、自我剪切激活、募集下游效应caspase及切割某些细胞成分的功能。其中，caspase?8亦称MACH或FLICE，属于起始caspase，于1996年由Muzio等克隆成功。caspase?8全长有479个氨基酸，其Ser217～Asp374构成大亚基，Asp384～Asp479构成小亚基，酶活性中心由QACQG组成。caspase?8主要定位于线粒体，在胞质和细胞核中也有分布。caspase?8在Fas、TNFR?1、DR4和DR5等死亡受体介导的细胞凋亡中起着极为重要的作用。基因敲除实验表明，caspase?8基因敲除(Konck out)小鼠的细胞可以抵抗TRNIL、TNF?α和FasL等诱导的细胞凋亡。

    本研究主要设计针对caspase?8的siRNA，抑制由caspase?8触发的级联反应诱发的细胞凋亡，在临床可以应用于抑制脑细胞以及心肌细胞的凋亡，以便更好的由脑及心肌损伤引起的阿尔海默氏综合症及心肌梗死等，具有深远的应用意义。

【】
［1］ Thomberry N A,Lazebnik Y．Caspases:enemies within［J］．Science，1998,281(5381)：1312?l316.

［2］ Salvesen G S，Dixit V M．Caspase activation:the induced?proximity model［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(20)：10964?10967.

［3］ Chinnaiyan A M，O'Rourke K，Yu G L，et al．Signal transduction by DR3,a death domain?containing receptor related to TNFR?1 and CD95［J］.Science，1996，274(5289)：990?992.

［4］ Yuan J．Transducing signals of life and death［J］．Curr Opin Cell Biol，1997,9(2)：247?251.

［5］ Novina C D,Sharp P A.The RNAi revolution［J］.Nature.2004,430(6996):161?164.

［6］ Birchmeier C,Birchmeier W,Gherardi E,et al.Met,metastasis,motility and more［J］.Nat Rev Mol Cell Biol,2003,4(12):915?925.