雷公藤多甙对佐剂性关节炎大鼠L5 DRG内SP、CGRP表达的影响

【摘要】  Objective To explore the effects of polyglycosides of Tripterygium Wilfordii Hook F(TⅡ)on the expression of SP、CGRP in L5 dorsal root ganglion of Adjuvant Arthritis rats model.Methods Adjuvant Arthritis rats were fed by TⅡ prevention and thrapy for 7 days,to observe the number and percentage of SP、CGRP positive neurons among total neurons in bilateral DRG(L5).Results SP、CGRP expression in neurons of L5 DRG in bilateral side in TⅡ preventive group and therapeutic group decreased apparently as compared with that of AA model group.Conclusion TⅡ may play a preventive and therapeutic role by decreasing the expression of SP and CGRP in L5 dorsal root ganglion.

【关键词】  polyglcosides of Tripterygium Wilfordii Hook F；adjuvant arthritis；substance P；calcitonion gene related peptide

    近年来研究表明神经系统对正常免疫功能的维持和免疫功能紊乱的发生至关重要。类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的自身免疫性疾病，多种细胞因子和炎症介质参与了RA发病，引起滑膜细胞增生、致炎、软骨破坏、关节畸形；此外，神经递质也参与了上述病变过程并且与疼痛传导有关。类风湿关节炎滑膜腔中有多种神经递质：如P物质（substance P，SP）、降钙素基因相关肽（Calcitonion gene related peptide，CGRP）、神经肽Y(Neuropeptide Y，NPY)。SP、CGRP等神经递质主要在脊神经节的初级感觉神经元胞体内合成，当关节炎发生时，其合成也发生相应变化。这些神经递质释放到关节腔后，能够与相应受体结合，引起关节内环境改变，介导神经源性炎症反应。中药雷公藤多甙（polyglycosides of tripterygium of wilfordii hook F,TⅡ）对RA具有良好的作用。在以往的实验中也观察到TⅡ对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis,AA）大鼠具有预防和治疗作用［1］。TⅡ的这种防治作用是否与影响相应脊神经节内神经递质的表达有关呢？这方面研究国内外尚未见报道。由于支配下肢的神经由L4～L6脊神经节发出，因此本实验通过观察应用雷公藤多甙预防和治疗佐剂性关节炎大鼠后，L5背根节内SP、CGRP表达的变化，为TⅡ作用机制的研究提供实验依据。

    1  材料

    1.1  实验动物成年SD雌性大鼠20只，200 g，2～3月龄，由四川大学实验动物中心提供。动物随机分为4组，每组5只。各组动物分笼饲养。

    1.2  主要实验仪器HH-L数显恒温水浴锅(江苏金坛荣华仪器制造有限公司)；艾柯实验室专用超纯水系统(成都唐氏康宁科技有限公司)；HM31石蜡切片机(德国MICROM公司)。

    1.3  主要试剂①第一抗体：兔抗SP、CGRP多克隆抗体（武汉博士德公司，效价为1∶200）；②SP免疫组化染色试剂盒（ZYMED）③浓缩型DAB试剂盒ZLI（Santa Cruz）。

    2  实验方法

    2.1  实验动物分组及处理动物随机分为4组，每组5只，并分别予以相应处理：A组（正常组）不造模，不给药物治疗；B组（模型组）于实验开始后，分别在各个大鼠左后足垫部皮下注射氟氏完全佐剂（Freund's Complete Adjuvant，FCA，Sigma公司产品）0.2 ml，不给药物治疗；C组（TⅡ预防组，TⅡ为湖南株州制药三厂产品）造模方法同模型组，造模后第7天开始灌胃给予TⅡ，用药剂量以大鼠体表面积换算公式，即1/d，TⅡ 30 mg·kg-１/次，共7天；D组（TⅡ治疗组）造模方法同模型组，造模后第19天开始灌胃给予TⅡ，1/d，TⅡ 30 mg·kg-1/次，共7天。

    2.2  灌注和取材

    造模28 d灌注固定后取材，取双侧L5 DRG后固定12 h，分别经50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%梯度酒精脱水各30 min，入氯仿Ⅰ、氯仿Ⅱ各透明30 min，石蜡包埋后用石蜡切片机连续切片，片厚7μm，各组每例L5 DRG等距离间隔取片，取片2组,每组5纵带（每带3张），分别用SP、CGRP抗体进行免疫组织化学染色。

    2.3  免疫组织化学染色用SP法做L5 DRG SP、CGRP免疫组化染色。

    2.4  免疫组化对照实验空白对照：用0.05 mol/L PBS 代替一抗，其余步骤不变。置换实验：用正常羊血清代替一抗，其余步骤不变。

    2.5  免疫组化阳性细胞计数显微镜下观察SP、CGRP免疫阳性细胞在L5 DRG的分布情况，计数每例动物每张切片上所有可见细胞核的阳性细胞和阴性细胞数。求出5例动物阳性细胞均数作为该组动物SP、CGRP的阳性细胞数,5例动物阳性细胞和阴性细胞之和的均数作为该组动物L5 DRG细胞总数 ，分别计算出SP、CGRP阳性细胞占细胞总数的百分比。

    2.6  统计学处理数据均采用均数±标准差（x±s）表示。应用SPSS11.0 for windows统计软件包，组间比较用单因素方差分析。凡Ｐ＜0.05，结果有统计学意义。

    3  结果

    3.1  TⅡ对大鼠L5背根神经节内SP表达的影响免疫组织化学结果显示SP主要存在于L5背根神经节内中、小型神经元，大神经元不表达。佐剂性关节炎形成后，模型组大鼠与正常组大鼠比较，L5背根神经节内SP表达明显上调；TⅡ预防组和治疗组与模型组比较，L5背根神经节内SP表达明显表1  各组大鼠L5背根神经节内SP表达的变化降低，与正常组无显著差异（见表1）。

    经统计学分析，正常组大鼠双侧DRG中SP阳性细胞的百分率基本相等(见表1)。模型组大鼠造模侧和非造模侧阳性细胞的百分率较正常组明显增高（P＜0.05），双侧无明显差异。TⅡ预防组和治疗组造模侧和非造模侧阳性细胞的百分率与正常组比较无显著性差异，与模型组比较显著降低（P＜0.05）。

    3.2  TⅡ对大鼠L5背根神经节内CGRP表达的影响免疫组织化学结果显示CGRP存在于大鼠背根节内的大、中、小型神经元中。佐剂性关节炎形成后，模型组大鼠与正常组大鼠比较，L5背根神经节内CGRP表达明显上调；TⅡ预防组和治疗组与模型组比较，L5背根神经节内CGRP表达明显降低，与正常组无显著差异（见表2）。表2  各组大鼠L5背根神经节内CGRP表达的变化经统计学分析，正常组大鼠双侧DRG中CGRP阳性细胞的百分率基本相等(见表2)。模型组大鼠造模侧和非造模侧阳性细胞的百分率较正常组明显增高（P＜0.05），其中以小细胞的阳性细胞百分率增加为主，双侧无明显差异。TⅡ预防组和治疗组造模侧和非造模侧阳性细胞的百分率较正常组增高，但与模型组比较显著降低（P＜0.05）。

    3.3  对照实验结果空白对照及置换实验切片均未见特异性染色的阳性神经元。

     人们早就发现，SP、CGRP等神经肽参与了RA中神经源性的炎症反应。这些神经肽主要在背根节神经元胞体内合成，当发生关节炎时，其合成会发生改变。Smith 等发现关节炎时原发病变侧背根节内SP阳性神经元增加了70%［2］；在FCA诱导的AA模型中，发现炎症诱导后5 d L4-L6 DRG内SP含量增加了30%～40%［3］；在单关节炎大鼠中，背根节内SP的前体物质PKA mRNA水平增加［4］。在对关节炎动物模型的研究中还发现向关节腔内注射佐剂后30 min，即可检测到相应脊髓节段脊神经节神经元内CGRP mRNA增多［5］。李文武等发现，在FCA注射后14 d动物形成多发性关节炎时，用原位杂交方法检测到L5 DRG内CGRP mRNA增多［6］。上述研究结果表明，当发生关节炎时，相应节段DRG中神经肽的合成增加。这类神经元发出一个通向脊髓的中枢突和另一个支配下肢关节滑膜的周围突，电生理研究发现后者主要是无髓的C类纤维，在正常情况下无髓C类纤维是静止的［7］。一旦关节腔内发生炎症反应，炎症介质可刺激该类纤维末梢，不仅能向胞体传导一个痛觉冲动，还能通过轴突反射向关节腔中释放神经递质，例如SP、CGRP等。神经递质释放到关节腔后，通过与相应的受体结合而引起血管扩张、组织水肿，还能刺激肥大细胞产生组织胺和其他炎症介质［8］。本实验观察到模型组大鼠在注射FCA后第2天，患肢出现红肿伴皮温升高，活动受限；注射FCA后第12天，该组大鼠不同程度出现对侧后肢继发性肿胀，并伴有关节强直，变形和活动受限；至第28天模型组动物全部处死并取双侧L5 DRG做免疫组织化学实验，观察到双侧L5 DRG内SP、CGRP阳性细胞数百分比均高于正常组（P＜0.05），该结果与报道一致［9］，提示L5 DRG内SP、CGRP增多与多发性关节炎的发生密切相关。佐剂性关节炎大鼠关节腔内存在多种炎性介质，例如IL-1、TNF、组织胺、PGE2（Prostaglandin E2）等［10］，这些炎症介质可以刺激无髓C类纤维末梢使其活化，通过传导伤害性刺激使正常情况下不合成神经递质（或者合成量很少）的初级神经元胞体明显上调神经递质的合成。文献报道，在多发性关节炎形成后，来自外周关于免疫机能亢进的伤害性传入增加，导致背根节初级神经元和脊髓内SP、CGRP进一步增多，通过负反馈调节抑制免疫反应，从而遏止多发性关节炎的发生和发展［11］。如前所述，雷公藤多甙具有抗炎和免疫抑制作用。有研究表明雷公藤的抗炎作用在于其提取物可以抑制环氧酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)及前列腺素E2(PGE2)的合成［15］以及抑制IL-1、TNF-α、IL-17的表达［12］。在本实验中，以AA大鼠作为研究RA的动物模型，从雷公藤多甙对于AA大鼠L5 DRG内SP、CGRP表达的影响来探讨其预防和作用机制。实验结果表明，TⅡ预防组继发侧L5 DRG内SP、CGRP阳性细胞数低于模型组，分析这一结果产生的原因可能为：在继发性关节炎形成前给予AA大鼠雷公藤多甙后，TⅡ可以在继发关节侧发挥抗炎作用，抑制关节腔中炎性介质释放，阻止伤害性刺激传入，无髓C类纤维不能活化，因此L5 DRG内SP、CGRP表达并不增加。本实验还发现TⅡ治疗组L5 DRG内SP、CGRP阳性细胞数低于模型组，提示在关节炎形成后，TⅡ在关节局部可发挥抗炎和免疫抑制作用，减轻了关节炎症症状，使伤害性刺激信息传入减少，因而DRG中SP、CGRP的合成也相应减少。TⅡ药效学研究也证明了上述结论［13］，AA大鼠经TⅡ治疗后，关节腔内炎性渗出水肿明显减轻，炎性细胞聚集减少，血流加快，表明TⅡ使微循环明显改善，从而有利于炎症引起的致痛物质和代谢产物的清除，使外周伤害性刺激信息尤其是痛信息传入减少，以致DRG中SP和CGRP的合成和初级传入末梢的释放均减少。

【文献】
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