线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型的研究基

【关键词】  脑缺血 大鼠 线栓法 MCAO

    随着当今社会的老龄化，人类脑血管病的发病率日益增加，我国每年新发脑卒中病例超过200万，每年死于脑卒中者约150万，生存的脑卒中患者目前多达700万。其中缺血性脑血管病占80%以上［1］，而大脑中脉闭塞(MCAO)占血管闭塞的43%［2］，因此制备一种较理想的脑缺血再灌注动物模型是研究脑血管病的重要手段及前提条件。局灶性脑缺血动物模型有许多种，建立一种具有良好重复性并能最大程度模拟人类缺血性卒中发生的动物模型一直是实验性脑血管病研究关注的重点。1986年，日本学者Koizumi［3］发明了线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型，1995年，我国也出现了相关的报道［4］。此后国内外学者对它不断改进，对模型原理，栓线制备，动物选择和操作过程等各个环节和实验处理因素的认识都得到和改进。本研究就线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型中的一些关键问题和影响因素作一综述。

    1  动物选择

    1.1  鼠种和种系

    制作脑缺血模型选用的实验动物有：小鼠、大鼠、蒙古沙土鼠、猫、狗、猪、羊以及灵长类动物猕猴等，其中最为常用的是大鼠，使用率超过90%。选用大鼠作为脑缺血模型具有以下优点：种系内纯性好，同系大鼠间遗传差异小，保证了试验对象的一致性；神经系统比较发达，与人类有类似的脑血管解剖特点；有极强的抗感染能力和生命力，常规操作一般不会引起伤口继发感染，能经受麻醉、外科手术及术后感染的考验，可对神经功能缺陷、药物疗效等长期观察提供可能；成本低，来源有保障；能够为动物保护者接受［2］。因此，大鼠已经成为目前最常用的局灶性脑缺血动物模型。

    在不同的大鼠品种之间，Fischer?344大鼠的大脑中动脉(MCA)变异较小，MCAO后形成的脑梗死体积一致性好；而Wistar?Kyoto大鼠的脑梗死体积最小，变异最大；Sprague?Dawley大鼠的模型效果居于二者之间。Markgraf等［5］用光化学法脑缺血模型比较了Sprague?Dawley及Wistar-Kyoto两种大鼠的梗死情况。SD大鼠可见较恒定的顶颞皮质梗死灶，梗死体积大于Wistar大鼠，变异较小。周边可见不完全性坏死区，即半暗带，占总梗死面积的91 %。Wistar大鼠梗死灶较小，但变异较大，不完全坏死区占总损伤区的30.1 %。考虑到不同大鼠品种的MCAO模型效果有异，以Fischer?344大鼠的模型效果最为理想，主张多选用Fischer?344大鼠进行模型制备，但因鼠源问题，目前应用较少。SD大鼠MCAO后，梗死体积较大，较恒定，且较温和，生长快，价格便宜，故用正常大鼠进行实验时一般常用SD大鼠［6］。此外，卒中病人常有高血压这个危险因素存在，因此在实验中高血压大鼠也常被选用。

    1.2   鼠龄

    人类卒中多发生在已有卒中多重危险因素的中老年人群中，脑梗死多发于老年人群，研究者在模拟人类脑血管疾病的发病过程中，往往期望选用老龄大鼠作为实验对象，而卒中模型多选择年青、健康动物。原因在于老龄大鼠的MCA发生了不同程度的迂曲、粥样硬化、管腔狭窄等解剖及病理上的改变，因此Wang等［7］用22个月龄的老年大鼠用线栓法制备脑缺血模型时，发现由于动脉扭曲或管腔狭窄使栓线难以推进即使栓线顶端正好位于MCA起始端，也引起MCA管腔增大而不能完全阻断血流，结果无一例脑梗死形成，故建议不宜盲目选用老龄大鼠制作线栓法MCAO模型，除非特别需求，鼠龄选择上仍以青年健壮为宜。另外也有研究发现，青年健壮大鼠的MCAO模型，在反映病症特点及用于检验临床药物疗效方面并不令人满意［8］，因此有些实验要在老龄大鼠进行。目前的实验中，仍以青壮年大鼠为优先选择。

    1.3  体重

    随着大鼠体重的增加，血管的内径会相应增加。对不同年龄段的大鼠应该选择不同直径的栓线与之相适应，从而确保最大限度地阻断血流，因此体重因素在模型的制备中也颇为关键。刘亢丁［9］认为:体重>350 g，颅内血管增粗，难以充分阻断MCA血流，体重<240 g，有时栓线难以插入，大鼠的体重以250～300 g之间为宜；辛世萌等［10］比较后亦认为体重250～300 g大鼠较体重200～240 g大鼠更适合线栓法。李小凤等［11］通过研究出大鼠体重与栓线直径的关系：体重240～260 g，插线直径0.20 mm；体重261～280 g，插线直径0.24 mm；体重281～300 g，插线直径0.26 mm。不同体重段的栓线直径对确保造模成功具有至关重要性。

    2  麻醉剂选择

    麻醉方法的选择尤其麻醉剂的应用是模型制备中的一个重要因素。卜碧淘［12］用Wistar?Kyoto大鼠对常用的几种麻醉剂进行实验，结果表明水合氯醛﹙400 mg/kg，ip﹚、苯巴比妥钠﹙200 mg/kg，ip﹚、乌拉坦﹙1000 mg/kg，ip﹚都可使局灶性脑缺血造模中大鼠的体温、呼吸、血气和酸碱度有明显影响，其中苯巴比妥钠和乌拉坦的降低脑温效果较水合氯醛明显，可使脑温降至28 ％～30 ％。这种低温脑保护作用是不可忽略的影响因素。水合氯醛和苯巴比妥钠可使呼吸频率下降一半左右，可持续1～2小时或更长时间，进而引起低氧血症和二氧化碳潴留，加重缺氧性脑损害，故不宜用于脑血管病的实验研究。而戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射(ip)对Wistar?Kyoto大鼠的生理状况影响最小，仅有轻度降温作用，故在MCAO模型制备的麻醉中，推荐2 %戊巴比妥钠45 mg/kg进行大鼠腹腔麻醉并保温。至于挥发性麻醉剂乙醚的吸入应用，因为量大易引起麻醉过量，造成动物死亡，量小又会出现麻醉不足，动物过早苏醒，目前不作为线栓法制备MCAO模型的麻醉选择。但乙醚可作为补吸麻醉剂，进行需要时的追加麻醉。郑健等［13］先用乌拉坦﹙0.3 g/kg，ip﹚浅麻醉大鼠，再以乙醚强化麻醉。其优点是动物苏醒较快，约需30 min，有利于观察神经体征。另外，动物年龄与药物代谢量也有一定的关系，老龄动物对麻醉药的耐受性下降，而且不同性别的动物对麻醉药品的耐受性也存在差异，比如雌性动物对戊巴比妥钠的反映敏感性为雄性动物的2.5～3.8倍［14］。因此，在麻醉过程中必须考虑动物的年龄、体重、性别、品系因素，使在模型的制作过程中尽量减少麻醉引起的对成功率及重复性等各方面的影响。

    3  手术

    3.1  手术部位

    国内外线栓法MCAO模型大多采用麻醉后颈部正中切口，此法逐步成为经典的手术入路。该手术入路要经过颌下腺、颈部淋巴结；需要暴露、分离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌、胸骨乳突肌、锁骨乳突肌和二腹肌等肌肉；气管、迷走神经、交感神经和舌咽神经丛需要在手术中分离并保护，因而具有一定的手术难度和风险。陈春富等［15］则采用由颈部旁侧入路，发现此法易行肌肉分离，术中出血少，手术视野暴露好，便于分离血管；同时，颈部旁侧入路对器官刺激性小，气道分泌物少，不用气管造瘘行机械呼吸，手术相对简单，手术标准化操作均在30 min内完成，闭塞成功率为94.1 %。

    3.2  翼腭动脉﹙PPA﹚是否结扎

    在线栓法发展史中对PPA是否结扎有着不同的观点。曹霞等［16］认为PPA支从颈内动脉（ICA）向前外侧分出，而且PPA较粗，与ICA交角小，栓线容易进入PPA而无法进入颅内，造成造模失败。若永久性PPA结扎则可较非结扎组的模型成功率提高26 %～40 %。亦有学者认为无需闭塞PPA。王耀明等［17］认为PPA位置深在，若结扎该动脉，神经肌肉损害严重，引起进食困难，给大鼠造成极大伤害，增加死亡率，故不提倡结扎PPA。Koizumi［3］认为由颈外动脉(ECA)残端进线时，用微动脉夹暂时夹闭PPA，进线成功后取下，保持PPA的开放。可以保持血管壁光滑，避免了结扎PPA引起涡流而形成血栓的可能，从而减少ICA内血栓形成的机会，栓线拔出后较快恢复灌注；并证明在梗死面积和神经功能缺损的体征方面均无明显差异。因此现在多主张暂时闭塞，这可兼顾脑缺血大鼠造模和再灌注研究，同时也明显降低手术难度，提高制备模型的成功率。

    4  栓线的影响

    4.1  栓线的直径及头端处理

    栓线直径的选择要根据动物大小而定，动物间体重差异不宜太大。栓线直径需要和ICA系统的内径相适应才能阻断ICA中栓线周围的血流，最大限度地阻断进入MCA的血流。插线前需要对栓线前端进行加工处理，其目的是阻断经大脑前动脉和前动脉来的侧支血流。有选用3—0和4—0尼龙线，研究者研究发现使用3—0尼龙线蛛网膜下腔出血(SAH)率明显高于4—0尼龙线 ［18］。采用Koizumi法时以头端5 mm覆以硅胶的4—0单尼龙线使其前端直径达0.25 mm～0.30 mm，这样栓线能顺利通过ICA颈段而停留在大脑前动脉近端从而引起局灶性脑缺血。但一些学者采用后发现栓线头端的涂料硅化树脂易形成阶段性球体，理论上存在缺血实验偏差，Longa则将栓线顶端烫成光滑的圆球。近来有学者在栓线头端覆以左旋多聚赖氨酸，认为这样可增加缺血的稳定性，保证可靠的缺血效果［19］。王耀明等［17］则利用石蜡，石蜡具有价廉易得，化学性质稳定，不刺激血管壁，不与血液成分反应等优点，在直径为0.24 mm尼龙线的前端5 mm涂以石蜡，使其直径达0.26 mm，头端变得光滑圆钝，结果证实它是一种理想的栓线制作法。马常升等［20］设计了一种插线前端的处理装置：用控温电烙铁﹙350 ℃±20 ℃﹚，在放大镜观察下，对直径为0.185～0.250 mm的尼龙线头端进行加工，制作出头端光滑、大小合适的理想栓线。胡国汉等［21］应用硅胶涂层尼龙线结合局部脑血流检测，制作出缺血2小时以上梗死体积稳定的脑缺血模型。尽管线拴的制备方法很多，但到目前为止还没有一种最为理想的方法。总之在栓线头端制备以何种方法最好，需要进一步研究探讨，但其目的都是为了加强阻塞作用及尽量减少损伤血管。当需要再灌注时，最好选择头端圆滑栓线，以致将栓线抽回ECA时不易脱出而引起出血。

    黄斌等［22］认为，栓线入ICA的深度要足够到达大脑前动脉，实验显示，颈总动脉(CCA)处插入，其深度为(18±0.5) mm，过短则不能阻塞。徐佳等在实验中发现MCA起始部与ICA起始部的距离在15.5～16.5 mm，与大鼠体重无相关关系；栓线插入深度小于等于16.0 mm的造模成功率为28.57 %，深度大于16.0 mm的造模成功率为83.33%；栓线法制作大鼠MCAO模型的插线深度最小为16.5 mm。他们认为，在16.5～20.0 mm是有效安全范围［23］。一般认为从ECA或CCA分叉处插入，其深度为18±0.5 mm；Garcia［24］所用的大鼠体重为(270±15) g，栓线进入颈内的深度为(18.5±0.2) mm。Holland等［25］使用300 g左右大鼠，进线深度为18.0 mm左右，这两位学者复制Longa的模型都比较成功。我国学者曹勇军［26］在实验中测量发现，经CCA插入的栓线长度为23±0.5 mm比较适宜，而经ECA插入的栓线长度为20±0.5 mm比较适宜。因为大鼠的体重与血管MCA长度呈正相关，并且大鼠的体重与栓线直径之间有正交互作用，因此栓线的长度、直径要与大鼠的体重相匹配。辛世萌等［10］也测得250～300 g大鼠CCA分叉处到MCA根部距离约为13～14 mm。因此，从CCA分叉插入的栓线长度为17 mm或18 mm都足以超过MCA根部。由此亦证实了栓线插入的长度在17～20 mm的性。

    5  模型制备成功的标志

    由于线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型栓线入颅后的操作是非直视下进行的，MCA血流阻断与否无法直接判断。因此，应该根据神经症状，在MCAO不同时间观察动物行为按不同方案进行，评分参照Bederson等［27］、Zea longa等［28］的五级4分评分方法并改进。0分：未见神经病学征象，即无神经功能缺损症状。1分：轻微的神经功能缺损，大鼠被提尾悬空时病灶对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直。2分：中度局灶性神经功能缺损，有向瘫痪侧旋转征象，大鼠被提尾悬空时脑缺血对侧前肢呈屈曲、抬高、肩内收、肘关节伸直。3分：重度局灶性神经功能缺损，有向病灶对侧跌倒征象。4分：无自发活动及意识水平下降。Memezawa等研究认为可以通过术中脑电图监测判断阻塞成功与否，而Elsaesser研究发现术中出现脑电波抑制较激光多普勒血流监测血流减少要晚5～10秒出现，故认为术中双侧激光多普勒血流监测对判断MCA0更敏感，更有效，当血流降到基础值的10 %～20 %即认为模型制备成功，且可以用来判断是否并发SAH。另外，组织学检查及脑代谢测定也是判断模型成功的重要方法，局部脑缺血，最好取缺血和非缺血区进行平行代谢测定。

    6  并发症

    6.1  SAH

    SAH为该模型最常见的并发症，Elaesser发现使用3?0尼龙线SAH发生率较4?0尼龙线SAH发生率高，因而为了减少SAH发生率在制作模型时应该选用合适的尼龙线。另外实验操作应轻柔，进线勿用力过度，栓线不能在血管内反复进退，否则容易造成SAH，而且很容易误解为模型成功，因为此时神经功能改变也很明显，但并不是由于栓塞引起的。发生SAH时，一些大鼠往往在抽线再灌注短时间内死亡。

    6.2  血栓形成

    血栓形成往往由于将栓线直接插入血管引起血管内皮的损害而导致，所以为了避免血栓形成一些研究者使用肝素处理栓线，然而Elsaesser等研究发现使用肝素和未使用肝素都未见血栓形成，使用肝素虽不增加SAH，但增加拔线后的出血，Kawamura等［29］观察发现仅仅当MCA和PPA持久阻塞时，ICA有血栓形成，所以是否使用肝素仍存在争论。总之，为预防血栓形成在插线过程中应尽量保持栓线与血管方向最大一致性，动作轻柔，栓线及其顶端要平整圆滑。

    6.3  窒息

    迷走神经直接影响动物的心率以及呼吸，在操作中对气管和迷走神经刺激过多过重可引起大鼠呼吸道分泌物增加，痰液阻塞呼吸道，呼吸功能抑制而出现呼吸困难，甚至窒息而死亡。当发现呼吸道分泌物增加时，应及时给予吸痰处理以防止窒息并尽量避免刺激神经。

    6.4  自发性高热

    有研究发现［30］线栓法MCA0≥2小时可导致自发性高热，并认为高热与下丘脑损害有关。Zhao等［31］研究发现线栓法MCA0后2小时内体温无改变，在2～4小时将下丘脑体温控制中枢损害，同时发现MCA短暂缺血2小时再灌注1小时保持麻醉和体温控制2小时，就能避免自发性高热。其机制可能是由于线栓在阻断MCA时，影响到下丘脑体温调节中枢的循环，导致脑缺血后高温的发生。这一发现提示了用线栓法制作持续性局灶性脑缺血模型时，必须预防缺血后高热的发生，以免影响实验结果的可靠性。

    6.5  其它

    Relodi研究发现MCA0后24小时内96只实验大鼠中有6只出现癫痫症状。

    7  展望

    目前脑血管疾病的基础与临床研究取得显著成效，动物模型制备的研究迅速，线栓法制备MCAO模型普遍为人们所接受，但也存在一定问题，影响模型制备的因素较多，所以应明确模型制备过程中的干扰因素，在实验开展之前，对整体的实验体系进行全面的评估和调整，寻找理想的控制易变因素的方法，以尽可能优化大鼠MCAO模型制备中的实验条件，从而制备出可靠、稳定、重复性好、成功率高的理想的MCAO模型，使得线栓法MCAO模型能最大程度地接近人类局灶性脑缺血的发病过程，从而为脑缺血病理生理的研究和药物的研制发挥更加科学有效的作用。

【】
  ［1］ Mayer TE,Hamann GF,BaranczykJ,et al.Dynamic CT perfusion imaging of acute stroke［J］.AJNR,2000,21(8):1441?1449.

［2］ 曹勇军，程彦斌。线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的改进与探讨［J］. 应用生杂志，2001;17(2)：198-220［3］ Koizmi J,Yoshid Y, Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edema:a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area［J］.Stroke,1986,16(8):1?8.

［4］ 李毅平，张雅洁，罗毅男，等.应用改良的血管内栓线技术制造大鼠局灶脑缺血模型.［J］中国神经精神疾病杂志，1995，21(2)：107?108.

［5］ Markgraf CG,Kraydieh S,Prado R,et al.Comparative histopathologic consequence of photothrombotic occlusion of the distal middle cerebral artery in Sprague?Dawley and Wistar rats［J］.Stroke,1993,24(2):286?293.

［6］ 胡建鹏,王 键.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型研究中的几个问题［J］. 中国比较医学杂志，2004，14（2）：115-118

［7］ Wang LC,Futrell N, Wang DZ,et al. A reproducible model of middle cerebral infarcts,compatible with long?term survival,in aged rats［J］. Stroke， 1995,26(11):2087?2090.

［8］ Kuge Y,Minematsu K,Yamaguchi T,et al.Nylon monofilament for intralaminal middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Stroke,1995,26(9):1655?1657.

［9］ 刘亢丁,苏志强,李逸平,等.实验性局灶性脑缺血再灌注动物模型的改进与评价［J］.中风与神经疾病杂志,1997,14(2):87?89.

［10］ 辛世萌，刘远红，聂志余.栓线长度、直径及大鼠体重与栓线法大鼠局灶性脑缺血模型关系的研究［J］.大连医科大学学报,2000,22(2):105?107.

［11］ 李小凤，孙圣刚，童萼塘.大鼠可逆性脑缺血模型复制方法的改进［J］.华中医学杂志，2000，24(4)：192?193.

［12］ 卜碧涛，王伟，张苏明. 大鼠脑缺血模型制作过程中麻醉方的选择与应用［J］.同济医科大学学报，1998，27(3)：202?205.

［13］ 郑健，董为伟.介绍一种大鼠大脑中动脉阻塞/再灌注模型［J］.中国应用生理学杂志，1996，12(4)：359?373.

［14］ 魏泓.医学实验动物学［M］.四川:科学技术出版社,1998.237?268.

［15］ 陈春富，李劲松.栓线法大鼠局灶性脑缺血模型的研究［J］.中风与神经疾病杂志，1996，13(1)：18?19.