苦参药材高效液相指纹图谱分析方法研究

【摘要】  目的:探讨一种评价苦参质量的高效液相指纹图谱分析方法的可行性及其应用价值。方法:采用高效液相色谱方法，Hypersil C18 (250mm×4.6mm,5μm) 色谱柱,以甲醇-乙腈-20mmol/L磷酸二氢钾溶液（加三乙胺调pH至8.0）为流动相,梯度洗脱。流速为0.8 mL·min-1,柱温：30℃；检测波长220nm,建立苦参药材HPLC指纹图谱共有模式,并对不同产地药材进行了相似度比较。结果:建立了苦参药材HPLC指纹图谱共有模式，并对不同产地药材进行相似度比较。结论:本研究建立的指纹图谱检测方法简便、快捷、可靠,可用于苦参药材的质量评价。

【关键词】  苦参;色谱法/液相;图谱

    【ABSTRACT】  Objective:To establish a method for analyzing HPLC fingerprints of Sophora flavescens Ait.Methods:The HPLC method was used with Hypersil C18 column (250mm×4.6mm，5μm).The mobile phases were consisted of methanol- acetonitrile -20mmol/L KH2PO4 solution (adjusted pH to 8.0 with triethylamine) respectively,gradient elute.The flow rate was 0.8mL·min-1.The temperature of column was 30℃.The UV detection wavelength was 220nm.Results:The mutual mode of HPLC fingerprints was set up and the similar degrees to the crude drugs of different habitats were compared.Conclusion:The method was simple and

    reliable,and it was capable of effectively controlling the quality of Sophora flavescens Ait.

    【KEY WORDS】  SOPHORA FLAVESCENS;Chromatography/Liqnid;COLLECTION OF ILLUSTRATION

    药用苦参为豆科植物苦参（Sophora flavescens Ait）的干燥根,具有清热燥湿、祛风杀虫、利尿等功效［1］。经药理实验和临床观察证明,其中主要含生物碱成分,同时还含黄酮、醌类等成分。其中苦参碱(matrine)为其有主要有效成分之一，具有抗肿瘤,平喘和抑菌作用;氧化苦参碱具有抗肿瘤,平喘等作用。黄酮类成分具有抗心律失常及抗真菌作用［2］。野生苦参在全国的分布较广,质量差异也较大,为了保证含苦参的中药制剂及临床处方药理作用，本文采用HPLC法对中药苦参进行了指纹图谱分析。

    1  材料与方法

    1.1  仪器  Agilent-1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，二极管阵列检测器（DAD），手动进样器，BS210S分析天平（北京赛多利斯天平有限公司），TU-1800S紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），C5860A超声脱气仪（天津开发区色谱分析仪器有限公司），412-1离心机（上海卫生器械厂），GM-0.33H隔膜真空泵及溶剂过滤器（天津市腾达过滤器件厂）。

    1.2  试药  乙腈、甲醇均为色谱纯,其他试剂为分析纯，水为重蒸馏水。氧化苦参碱对照品(110780—200405),苦参碱对照品(110805—200306),槐定碱对照品（110784—200303）由药品生物制品检定所提供。本实验共收集河北、山西和内蒙等地产苦参药材样品11批,经张家口市药品检验所孟燕主任中药师鉴定均为豆科植物苦参（Sophora flavescens Ait）的干燥根。

    1.3  方法

    1.3.1  色谱条件

    色谱柱Hypersil BDS C18（250mm×4.6mm,5μｍ）；柱温：30℃；流动相： A：20mmol/L磷酸二氢钾溶液,加三乙胺调pH至8.0，B：甲醇—乙腈（1∶3），线性梯度洗脱（0～12min为B5%～15%； 12～30min为B15%～40%； 30～50min为B40%～55%；50～60min为B55%～70%）。流速0.8mL·min-1；检测波长：220nm；手动进样20μL。

    1.3.2  溶液配制

    1.3.2.1  对照品溶液的制备  精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱对照品适量,分别加50%甲醇溶解,制成每1mL含苦参碱和槐定碱各0.05mg,氧化苦参碱0.15mg的溶液。

    1.3.2.2  供试品溶液制备［3］  以苦参对照药材为样品，选择不同溶剂，不同提取方法进行对比实验，分别以五种不同的提取方法制备供试品溶液。

    ①50%甲醇回流方法：精密称定苦参药材粉末(过40目筛) 0.2g，加50%甲醇50mL于圆底烧瓶中,称定质量。回流1h(沸腾开始计时),放冷，用50%甲醇补足质量。滤纸滤过,取续滤液,经0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

    ②85%乙醇回流方法：精密称定苦参药材粉末(过40目筛) 0.2g，加85%已醇50mL于圆底烧瓶中,称定质量。回流1h(沸腾开始计时),放冷，用85%乙醇补足质量。滤纸滤过,取续滤液，经0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

    ③水超声提取方法：精密称定苦参药材粉末(过40目筛) 0.2g，置具塞瓶中,加水50mL，称定质量，放置24h，超声提取45min，放冷，用水补足质量。取上清液离心（4000r/min）,微孔滤膜(0.45μm)滤过，作为供试品溶液。

    ④50%甲醇超声方法：精密称定苦参药材粉末(过40目筛) 0.2g，置具塞瓶中,加50%甲醇50mL，称定质量，放置24h，超声提取45min，放冷，用50%甲醇补足质量。取上清液离心（4000r/min）,微孔滤膜(0.45μm)滤过，作为供试品溶液。

    ⑤氯仿加浓氨溶液超声方法：取苦参药材粉末约(过40目筛)0.2g，置于锥形瓶中,加入氯仿50mL,浓氨溶液0.3mL，称定质量。超声提取45min，放冷，用氯仿补足质量。取上清液离心（4000r/min）,微孔滤膜(0.45μm)滤过，作为供试品溶液。

    用5种方法制备的供试品溶液，分别在上述色谱条件下进样，记录色谱图。以氧化苦参碱、槐定碱和苦参碱为指标，结合测定结果和色谱图的分离情况，综合评价提取效果，选定50%甲醇超声方法为苦参HPLC指纹图谱供试品溶液的制备方法。

    2.1  精密度试验  取同一供试品溶液,在上述色谱条件下，连续进样6次,记录指纹图谱。结果表明,各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致，RSD为0.16%～1.35%。

    2.2  重现性试验  精密称取同一种样品6份,按选定方法制备供试品溶液,在上述色谱条件下，分别进样记录指纹图谱。结果表明,各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致，RSD为0.57%～1.89%。

    2.3  稳定性试验  取同一供试品溶液,在上述色谱条件下，分别在0、2、4、8、16、24h进样测定,记录指纹图谱。结果表明,各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致，RSD为0.81%～2.86%。

    2.4  指纹图谱建立与分析

    2.4.1  样品指纹图谱测定  分别取河北产地苦参药材样品10批，按选定方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样20μL，记录60min HPLC色谱图。表2  10批样品共有峰相对峰面积（略 ）

    2.4.2  共有峰的确定  对上述10批苦参药材所测得指纹图谱进行分析，选择稳定性较好，吸收强，特征明显的色谱峰为共有峰，共标定12个峰，见图1。其中6号峰为氧化苦参碱，分离良好，峰位居中，保留时间稳定，定为参照峰。各共有峰相对保留时间及相对峰面积见表1、2。

    2.4.3  相似性评价  指纹图谱相似度评价采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，对11批不同产地苦参药材进行相似度评价。本文以夹角余弦和相关系数两个统计量为测度,对11批药材的相似度进行了,结果见表3。表3  不同产地样品相似度分析结果（略 ）

    3  讨论

    3.1  利用高效液相色谱仪的二极管阵列检测器对样品的吸收波长进行分析,结果在220nm检测波长下,基线较稳定,色谱峰较多,信息丰富,故选择220nm为检测波长。

    3.2  提取方法的选择  实验以尽可能多体现苦参两大主要成分为原则,设计样品溶液制备方法。在考察的五种供试品溶液提取制备方法中，测定结果显示氯仿加氨水超声提取生物碱含量最高，但出峰数量少，且操作繁琐，易造成误差；乙醇回流方法效果也较好，因乙醇浓度较高，与流动相不匹配，指纹图谱测定易出现负峰；水超声提取方法相对较差；50%甲醇超声和50%甲醇回流两种方法差别不大。对测定结果综合考虑，选定50%甲醇超声提取法制备供试品溶液。该制备方法操作简便，供试品溶液指纹图谱响应峰多,各峰响应值较高，且样品各峰分离良好。

    3.3  流动相的选择  共进行3种流动相体系不同浓度、不同比例及不同梯度程序实验，结果发现甲醇—磷酸盐水溶液—三乙胺流动相洗脱效果最好，但由于甲醇－水系统的热力学和可压缩性因素,在梯度洗脱时基线漂移较严重；而乙腈—磷酸盐水溶液—三乙胺系统的流动性基线平稳，但洗脱效果差；故选择一定比例的甲醇—乙腈—磷酸盐水溶液—三乙胺组成流动相，基线相对较平稳且分离效果较好。等度洗脱色谱峰集中在前30min，分离度差，采用梯度洗脱方式，可保证得到良好的分离。流动相的pH越高，分离效果越好，但应考虑到色谱柱的承受能力，故选择pH8.0为易。

    3.4  实验中分别试用Hypersil BDS C18柱（250mm×4.6mm,5μm）、Zorbax ODS C18 (250mm×4.6mm，5μm)和 Zorbax XDB C18 (150mm×4.6mm，5μm)三种色谱柱，结果显示Hypersil BDS C18柱（250mm×4.6mm,5μm）柱能够将药材各种成分很好地分离，达到比较理想的效果。同时对柱温和流速反复调整，在选定的色谱条件下，分离效率高,各峰分布较均匀，保留时间稳定适中，60min后无特征峰继续出现。经方法学验证表明，其稳定性、精密度和重现性均符合指纹图谱要求［4］。

    3.5  指纹图谱相似度评价  本实验采用了HPLC对苦参进行分析,由生成指纹图谱可以看出,11批苦参药材指纹图谱中主要色谱峰的整体图貌基本一致。各样品HPLC指纹图谱虽存在一定差异,但均具有相同的色谱特征峰。同时相似度评价结果表明,不同产地的相似度计算结果均在0.9以上,相似度较高,说明地域性差异不明显。利用药典委员会颁布的指纹图谱软件,能够很好地对苦参药材指纹图谱进行相似度评价，对鉴别药材的真伪优劣有重要的价值。

【参考】
  1 田代华.实用中药辞典［M］.北京:人民卫生出版社,2002.1082

2 苗抗立,张建中,董　颖,等.苦参的化学成分及药理的研究进展［J］.天然产物研究与开发,2001,13(2):69

3 马仁玲,周红华,于喜水,等.苦参药材提取方法的LC/MS研究［J］.中成药，2003，25（10）：831

4 国家食品药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)［J］.中成药，2002，22（10）：671