组织工程骨血管化的研究进展
作者：何清义 李强 温立升 许建中
【关键词】 骨髓基质干细胞
组织工程骨具有巨大的临床需要及应用前景，用组织工程骨(tissue engineering bone，TEB）修复骨缺损的研究方兴未艾。目前大部分的研究都停留在小动物(如鼠、兔)体内原位或异位成骨，修复部位大都为非负重骨缺损，新生的骨组织还不能满足临床应用的需要。目前应用大块TEB修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，使修复归于失败，其主要原因在于未能很好解决TEB的血管化问题〔1〕。因为小块组织工程骨植入体内后，早期依靠组织液的渗透可获得营养，而大块组织工程骨仅靠组织液的渗透是远远不够的。目前国内外关于血管重建(包括毛细血管)研究尚处于起步阶段，主要方法有：(1)血管内皮细胞或血管平滑肌细胞+生物材料〔2、3〕；(2)生物材料+预制血管蒂或筋膜包裹；(3)生物材料+促血管生长因子〔4〕。第1种方法需要大量培养、扩增血管内皮细胞，周期长，而且需要从自体切取血管用于血管内皮细胞的分离、培养；第2种方法能够得到血管化的TEB，但必须将TEB异位植入，待血管束长入后再断蒂用于移植，不但有异位创伤的问题而且等待的时间也较长。直接应用促血管生长因子在体内迅速降解为无活性的片段，并且其在体内的半衰期较短，会很快流失在周围组织中，达不到理想的效应浓度；如果采用首次大剂量给药，易导致局部血管瘤〔5〕。现常用的缓释技术如材料表面化学结合、高分子材料微囊包裹技术等，不仅损害其生物活性，其缓控释作用也存在多方面不足。
有学者通过尽量模拟体内血管发生与生成的生理过程，构建组织工程血管来解决此问题。血管的形成分为血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)。血管发生主要发生于胚胎期，通过内皮前体细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)分化成内皮细胞，在中胚层内形成血管丛，此过程受VEGF控制；血管丛的塑型、扩张属于血管生成过程，主要由血管生成素1(angiopoietin1,Ang1)调控〔6〕。血管分子生物学已破译了许多复杂的血管形成级联反应，包括：(1)启动：缺氧环境刺激VEGF分泌并结合VEGF受体(VEGFR)，刺激内皮细胞增殖、迁移进入微血管间隙；(2)增生：活化的内皮细胞形成纤维条索状突起结构；(3)塑型：Ang1与内皮细胞受体Tie2结合〔7〕，吸引周细胞、平滑肌细胞包绕幼稚血管。旧的围绕基质消化，并形成新的基质沉积。中空结构形成，周细胞环绕内皮，形成围绕血管的连续基膜。(4)血管成熟：在体内，通过灌注率和剪切力、低氧、其他生长因子等代谢因素作用于内皮，使多余细胞进入血循环、去分化、凋亡而成熟。因此，血管形成是一个有多种内分泌、旁分泌因子相互作用的多步连续反应，是一个生理需要与病理修复持续的动态过程，它涉及到细胞(EPCs、内皮细胞)，细胞因子(VEGF、Ang1)以及生物应力等。内皮细胞是血管生成过程中的最重要的调节细胞，所有的成血管因素皆围绕它发挥作用。但内皮细胞培养耗时费力，其规模扩增相当困难，并且内皮细胞的获取创伤较大，来源(静脉或动脉血管)极其有限，因而远远不能满足临床需要。内皮前体细胞(EPCs)存在于骨髓、脐带血与外周血中，前二者含量较丰富，后者含量较少(EPCs仅及前二者的十分之一)，EPCs被称为睡眠中的成体干细胞(sleeping adult stem cells)，它不仅可以分化为内皮细胞，还可分化为心肌细胞、平滑肌细胞等，其特征性的表型为表达三种细胞标记(CD133，CD34，VEGFR2）〔8、9〕。最新的研究表明EPCs在成体血管形成中起着重要作用，在缺血后肢、缺血心肌、损伤角膜、损伤皮肤以及肿瘤增生的血管形成中维持血管形成，替代脱落的内皮细胞并最终完成内皮化〔10~12〕。Yuyama等〔13〕的临床研究发现，CD34阳性的EPCs能够从骨髓中迁移出来参与新生血管的发生(neovascularisation)，运用含有EPCs的骨髓单核细胞(27×10～07×10 9 ells／人)注入缺血肢体的腓肠肌(试验组),与注射生理盐水的对照组比较，4周后其腋踝指数、透皮氧分压、静止疼痛和无痛行走等指标都有显著提高，这种改善和提高一直持续到24周，作者认为EPCs注射是一种安全、有效的性血管手段。从狗的外周血中获取EPCs，经扩增后预植入Ⅰ型胶原网中，聚亚胺酯(polyurethane)包裹其作为内衬面并形成管腔，构成组织工程血管并移植入狗的两侧颈动脉，3个月后形成内衬为乳白色的血管，腔内覆盖连续平整的内皮细胞，Ⅷ因子染色阳性，并且该动脉腔内无血栓形成。因此，EPCs可以作为内皮细胞的较好来源〔14〕。限制EPCs的临床应用主要在于EPCs的数量很少，根据不同的分离方法获得的EPCs数目不同，用流式细胞仪分离的细胞数量在3 000～5 000个／ml之间，用免疫磁珠分离的细胞数量在70~210个／ml之间。如何使EPCs快速增殖与分裂以及利用其促进血管形成是目前研究的热点之一。
生长因子是血管形成中最核心的因素之一，生长因子形成复杂的系统调控血管的发生与形成。目前血管形成领域研究较多的是VEGF和Ang1。VEGF家族包括VEGFA、B、C、D和胎盘形成因子，其中VEGFA是研究较集中的因子，具有四种异构体，分别由121、165、189、206个氨基酸组成，VEGF 121含量最多，而VEGF 165活性最强，它通过与内皮细胞表面的VEGF受体结合，激活一氧化氮合成酶反应，刺激内皮细胞分裂与增殖。研究表明VEGF作为强有力的趋化因子，能够促进EPCs从骨髓中迁移出来并参与新生血管的形成〔15〕Henrich〔16〕等研究发现含有VEGF 165的血清不但促进人EPCs数量的增殖与分化，并且刺激EPCs参与血管形成，VEGF 165在人EPCs的分化中也起着关键作用。
但临床上直接应用VEGF效果不佳，因其在体内的半衰期较短，并迅速降解成为无活性的片段。应用基因转染的方法将编码VEGF的基因转入EPCs，能够明显促进EPCs的增殖和粘附，促进EPCs整合进入新生血管。试验表明应用腺病毒VEGF基因转染的EPCs能够极大增加裸鼠缺血后肢的新生血管形成和血流恢复，使因缺血坏死截肢率降低637％〔17〕。临床上采用含VEGF165的裸质粒转染缺血心肌，可显著提高EPCs的迁移水平和在缺血心肌的新生血管形成。研究还发现，转染VEGF基因的患者血清中VEGF一过性升高，并导致EPCs数量显著上升，相对于转染空载体和生理盐水注射组，其血管内皮细胞数量增加了30倍，有力地促进了缺血肢体的血管形成。在美国的多个医疗中心，已经运用VEGF腺病毒真核表达载体进行基因治疗，随机、双盲试验表明VEGF有强大的血管保护作用(Vasculoprotective)〔18〕。由此可见VEGF在促进EPCs的增殖、迁移、趋化、分化的作用上举足轻重，VEGF的基因转染具有确切、高效、安全的特点。
血管生成素(angiopoletin，Ang)是另外一种重要的与血管生成相关的因子，特别是Ang1，它在肌肉、子宫等血管丰富的组织内广泛表达，特异性作用于内皮细胞Tie2受体，吸引血管平滑肌细胞、周细胞等血管周围细胞包绕、支持内皮细胞，形成完整的血管壁，促进血管重塑、成熟，由单内皮细胞层向多细胞层过度，完成血管的精细结构以及血管成熟。
Thurston等发现VEGF以及Ang1都能特异性地促进内皮细胞的增殖与分裂，VEGF作用于血管发生，并且主要促进血管的长度增长，增加血管的通透性；而Ang1作用于血管的形成，并主要促进血管直径增生，减少血管的通透性，促进血管增厚。VEGF与Ang1具有协同作用，不但可以促进血管生成，并且具有防止血管渗漏，促进缺血心肌、肢体的血管再形成。Ang1通过与Tie2结合促进内皮细胞存活、血管形成、塑型、成熟和稳定，并能抑制微血管的凋亡，抑制一氧化氮合成酶mRNA表达减少，能够提高肺动脉高压小鼠的生存率和肺动脉的血液动力学〔19〕。室验组用编码Ang1的腺病毒注射观察肌皮瓣的血管形成情况，与PBS注射以及空载体对照组相比，其肌皮瓣活性毛细血管术后7 d增加46％，14 d增加98％，并提高了肌皮瓣的血液动力学〔20〕。近期研究表明Ang1和VEGF共同基因转染能够更好促进缺血心肌的动脉形成(arteriogenesis)和血管形成。单纯VEGF 165或Ang1基因转染，仅能使缺血心肌毛细血管密度上升36％，如果二者协同转染，可使血管密度上升75倍〔21〕。
已有大量的研究证明骨髓基质干细胞(MSCs)不仅具有良好的成骨细胞分化潜能和高成骨活性，而且具有强大的增殖潜能，来源方便，以微小的创伤即可从自体骨髓中分离并易于体外扩增纯化，可以满足自体组织工程骨构建的需要，而且避免了免疫排斥问题。因此，MSCs是目前骨组织工程种子细胞的最佳选择，并日益受到重视。作为实验研究技术，MSCs的分离获取和成骨细胞的定向诱导分化的方法已接近成熟。因此可以利用VEGF和Ang1双重基因转染的自体EPCs与MSCs混合培养，MSCs可旁分泌多种细胞因子，促进EPCs的增殖以及血管形成，而经VEGF、Ang1双基因转染的EPCs等也能促使MSCs向内皮细胞分化，建立血管形成的良性循环，从而促进组织工程骨的快速血管化〔22〕。
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