退变颈椎间盘组织中细胞凋亡及Caspase-8表达的研究

【摘要】  目的 探讨凋亡相关蛋白Caspase-8在颈椎间盘退变中的作用。方法 采用原位DNA片段末端标记和免疲组织化学方法，对比观察57例颈椎病退变颈椎间盘组织细胞及42例创伤对照颈椎间盘组织细胞凋亡状态及凋亡相关蛋白Caspase-8的表达。结果 57例颈椎病退变颈椎间盘组织细胞凋亡率(AI)为54.0%，Caspase-8蛋白阳性细胞百分率为43.0%；42例创伤对照颈椎间盘AI为39.6%，Caspase-8蛋白阳性细胞百分比为35.4%。两组间AI、Caspase-8蛋白表达差异均有显著性意义(P＜0.05)。Caspase-8表达越强，凋亡细胞数越多。结论 Caspase-8蛋白参与了颈椎间盘组织中细胞调亡的调节，可能在颈椎病颈椎间盘退行性变发生和中发挥重要作用。

【关键词】  颈椎间盘；退行性变；细胞凋亡；Caspase-8

　
　　Abstract: Objective  To explore the mechanism of cervical intervertebral disc degeneration. Methods  The apoptotic status and the expression of Caspase-8 in 57 cases of degenerative cervical intervertebal disc tissues and 42 of traumatic normal cervical intervertebal disc tissues were detected with TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL)and immunohistochemistry methods. Results  The average apoptotic index(AI)in 57 cases of degenerative cervical intervertehal disc was 54.0%，which was significantly higher than that of 42 traumatic normal cases (39.6) ( P＜0.05). The expression rates of Caspase-8 protein in 57 cases of degenerative cervical intervertebal disc were 43.0%，which was significantly higher than those of 42 traumatic normal cases(35.4%)(P＜0.05). The stronger Caspase-8 protein expressed，the bigger the apoptotic index was. Conclusion  Caspase-8 take part in the occurrence and progression of cervical intervertebal disc degeneration.

　　Key words: cervical intervertebral disc; degeneration; apoptosis; caspase-8

    细胞凋亡是生物体调节组织自稳的生理过程，依赖一类对天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspases)产生的级联反应。Caspase-8是死亡受体介导的凋亡途径中关键的启动子，能够通过寡聚而自身切割活化，并能激活下游Caspase，产生凋亡效应。Caspase-8基因甲基化、基因突变及其它表达异常可导致细胞凋亡和增殖失调，从而参与某些疾病的发生。近年来有关细胞凋亡及凋亡相关蛋白在退变性疾病的发生及进展中所起作用越来越受到人们重视。本研究采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)和免疫组织化学方法对57例颈椎病退变颈椎间盘组织及42例创伤对照颈椎间盘组织细胞凋亡状态及凋亡相关蛋白Caspase-8的表达进行研究，探讨凋亡相关蛋白Caspase-8在颈椎间盘退变中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　颈椎间盘组织细胞(C3-C7)取自2006年5月至2007年9月本院骨科。实验组为经手术的脊髓型颈椎病患者，标本来源于脊髓型颈椎病患者前路手术所取得的椎间盘组织共57例，男34例，女23例，年龄46～74岁。均经术后病理检查证实为退变椎间盘组织的脊髓型颈椎病患者。对照组为经手术治疗的颈椎创伤患者，伤前无腰腿痛病史，标本来源于颈椎创伤患者前路手术所取得的椎间盘组织共42例，男31例，女11例，年龄16～38岁，术后病理检查证实为无明显退行性改变椎间盘组织。

　　1.2  方法

　　1.2.1  脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 
　　参照Gavrieli［1］进行TUNEL法检测细胞凋亡，细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每例在400倍镜下，随机观察计数6个视野，记录阳性细胞数，以平均100个细胞核中含凋亡细胞个数为凋亡率(apopotic index，AI)。

　　1.2.2  免疫组织化学染色法

　　一抗为兔抗人Caspase-8多克隆抗体，为武汉博士德公司产品。所有标本均在同一条件下采用链霉亲和素蛋白—过氧化物酶连接法(SABC)进行免疫组织化学染色，一抗稀释度为1∶100，各步骤间均用PBS洗片。阳性对照选用经病理诊断为退变椎间盘的病理石蜡切片，用PBS代替一抗为阴性对照。细胞核出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞，每例切片双盲法计数，在400倍镜下，随机观察计数6个视野，记录阳性细胞率，即6个视野内阳性细胞总数/6个视野内细胞总数×100%。

　　1.3  统计学方法

　　采用卡方检验。

　　2  结果

　　2.1  颈椎间盘组织细胞凋亡情况  根据TUNEL法，检测颈椎间盘组织中阳性染色细胞的结果(如图1、2，见封4)，细胞凋亡率颈椎病退变组明显高于创伤对照组，见表1。表1  创伤对照与颈椎病退变颈椎间盘组织中的细胞凋亡（略）

　　2.2  创伤对照与颈椎病退变颈椎间盘组织细胞中Caspase-8蛋白表达情况  颈椎间盘组织中Caspase-8蛋白表达部分在椎间盘髓核细胞和类软骨细胞中，其胞膜及胞浆无棕黄色染色，细胞核出现棕色颗粒(如图3、4，见封4)。退变组中Caspase-8蛋白表达阳性率明显高于对照组，经检验差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。表2  创伤对照与颈椎病退变颈椎间盘组织中Caspase-8蛋白表达（略）

    脊髓型颈椎病(cervical spondylotic myelophathy，CSM)是颈椎退行性改变导致脊髓受压或(和)脊髓供血障碍引起的脊髓功能障碍性疾病，以椎间盘变性、颈椎力学性能异常为始发因素［2-3］。细胞凋亡与细胞产生一样都是机体的生理过程，两者并存，且保持动态平衡，这种平衡是保持机体组织器官形态学稳定性，机体生理功能和内外环境稳定的必要条件。如果细胞凋亡过多或过少，导致这种平衡破坏，就会导致疾病的产生［4］。有作者提出不断发生的细胞凋亡是随年龄增长椎间盘组织细胞减少的主要原因［5］。Gruber等发现，退变的椎间盘标本中，椎间盘细胞的凋亡率高达53%～73%［6］。而椎间盘组织细胞数量的减少、生理活性的降低与细胞外基质(尤其是胶原构成成分的变化)的改变互为因果，相互影响，为椎间盘纤维环破裂、髓核突出提供了组织病基础［7］。在椎间盘退变过程中，组织细胞排列有地减少，髓核大小发生了很大的变化。其中功能性细胞数量的减少更为明显，且即便是存活的细胞，其生理活性亦明显降低［8］。伴随着椎间盘退变、尤其是细胞数量的减少，肯定有不同程度的细胞凋亡发生［9］。Gruber等［10］通过对突出和正常椎间盘组织的对比研究，指出不论是否发生椎间盘突出，随着年龄的增加都有大量椎间盘细胞凋亡发生。椎间盘退变主要表现在椎间盘基质中胶原、蛋白多糖及水含量的变化，这些都是由于椎间盘细胞的结构和功能变化引起的。有理由相信，细胞凋亡和细胞生理状况的变化是椎间盘基质大分子变化的根源［4］。

    Caspase家族是凋亡的主要执行者［11］。Caspase-8的活化依赖于死亡受体途径，当死亡受体与配体结合后，通过一种叫FADD(Fas-as-sociated death domain)的接头蛋白使Procaspase-8聚集，聚集的Procaspase-8 通过自身或相互之间的切割产生有活性的Caspase-8，激活的Caspase-8又可激活下游Caspase-3［12］。活化的Caspase-3能裂解DNA、修复相关分子、凋亡抑制蛋白及骨架蛋白等，细胞最终裂解。因此，Caspase-8代表了细胞凋亡的死亡受体途径。

　　本实验结果表明，退变颈椎间盘组织细胞凋亡增加，凋亡相关蛋白Caspase-8在退变颈椎椎间盘组织中表达率较高。Caspase-8蛋白表达越强，椎间盘细胞凋亡越多。因此，椎间盘细胞在Caspase-8蛋白表达较高的情况下，可能进行超常的凋亡，从而破坏了细胞增殖与凋亡的动态平衡，这可能是颈椎椎间盘退变发生及进展的原因之一，同时，凋亡相关蛋白Caspase-8介导的细胞凋亡的膜受体通路可能是颈椎病退变颈椎间盘组织细胞凋亡的主要信号通路之一。可以通过研究颈椎病椎间盘组织细胞凋亡机制，来进一步验证Caspases活性的变化与颈椎病椎间盘组织细胞凋亡改变之间的关系，通过抑制Caspases-8的活性来寻找颈椎退变疾病的新途径。

【】
  　　［1］Gavrieli，Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fmgrnentation［J］.J Cell Biol，1992，119(4)：493-501.

　　［2］Bernbardt M，Hynes RA，Blum HW，et al.Current concep ts reviex：cervical spondylotic myelopathy［J］.J Bone Joint Surg，1993，75：119.

　　［3］陈锋，施杞，韦贵康.脊髓型颈椎病发病机理研究进展［J］.中医骨伤科杂志，1999，12：52-54.

　　［4］谢林，施杞，赵乔珍，等.芪麝颈康丸对椎间盘细胞凋亡的影响［J］.中国中医骨伤科杂志，2003，11(5)：125.

　　［5］Buck walter JA.A gine and degeneration of the humanintervertebral disc［J］. Spine，1995，20：1037.

　　［6］Gruber HE，Hanley EN.A nalysis of aging and degeneration of the human intervertebral disc Comparison ofsurgical specimens with normal controls［J］. Spine，1998，7：751.

　　［7］夏玉军.转染外源性转化生长因子B1基因对兔髓核细胞凋亡的影响［J］.青岛大学医学院学报，2003，39(2)：140-141.

　　［8］Meachim.Fine structure of juvenile human nucleuspulposus［J］.J Anat，1970，53：544.

　　［9］陈晓亮，胡有谷.椎间盘超微结构观察［J］.中华骨科杂志，1990，10：331.

　　［10］Gruber HE，Hanley EN.Analysis of aging and degeneration of the human intervertebral disc［J］.Spine，1998，23：757.

　　［11］Hengartner Mo.The biochemistry of apoptosis［J］.Nature，2000，407(6805)：770-776.

　　［12］Liu XS，Zou H，SLAUGTERC，et al.A heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis［J］.Cell，1997，89(2)：175-184.