邻苯二甲酸二丁酯对小鼠骨髓微核和精子形态的影响

【摘要】  目的 了解邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对微核试验和精子畸形试验的影响。方法 将昆明种小鼠随机分为5组，DBP染毒剂量为500mg/kg(低剂量组)，1000mg/kg(中剂量组)和2000mg/kg(高剂量组)，以及阴性对照组(玉米油)和阳性对照组(环磷酰胺，40mg/kg)，每只小鼠计数1000个骨髓嗜多染红细胞(PCE)和每个剂量组的小鼠计数1000个精子的形态。结果 中、高剂量组微核率与阴性对照组相比明显升高(P＜0.05)，且各剂量组微核率随染毒浓度的增加而升高，呈现剂量-反应关系(r=0.937，P＜0.01)；中、高剂量组精子畸形率与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，且各剂量组精子畸形率随染毒浓度的增加而升高，呈剂量-反应关系(r=0.904，P＜0.01)，畸形精子中以无钩为最多，其次是香蕉形、尾折叠、双头，分别为4.5%、3.09%和1.32%，结论 DBP染毒在一定剂量下对小鼠骨髓微核试验和精子畸形试验呈现阳性结果。

【关键词】  邻苯二甲酸二丁酯；微核；精子畸形

　　Abstract: Objective  To explore effects of dibutyl Phthalate on the microkemel and sperm cell abnomalities in mice. Methods  40 Kunming strain mice were divided into 5 groups, which were control group, masculinecomparison group, low dosage group(500mg/kg), medium dosage group (1000mg/kg) and high dosage group(2000mg/kg). The microkemel and sperm cell abnomalities were analyzed. Results  The micronuclear rate in medium dosage group and high dosage group were significantly higher than that of control group(P＜0.01). The ratio of sperm malformation in middle group and high group were higher than those of controls (P＜0.01).The ratio of sperm malformation increased in dose-dependent manner with dose, a dose-response relationship was found. Conclusion  The DBP contamination presents the positive results under the certain dosage to the mouse marrow micronucleus experiment and the spermatozoon abnormal experiment.

　　Key words: dibutyl phthalate；micronucleus；sperm shape abnormalit

    邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)是最常用的一类增塑剂，主要用于塑料增塑剂、润滑剂、树脂溶剂、印刷油墨、胶黏剂、化妆品、农药载体等［1］，广泛存在于空气、水体、土壤及生物体内，可通过饮水、食物、皮肤接触(化妆品)和呼吸进入人体。有研究发现在食用油及家庭厨房油烟雾中也含有DBP［2-4］，DBP的健康危害越来越引起人们的重视。目前对DBP的研究多集中在生殖发育毒性，关于DBP的致突变毒性国内报道甚少，本文采用微核试验和精子畸形试验来研究DBP的遗传毒性，了解DBP对小鼠体细胞和生殖细胞的致突变作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物

    选用宁夏医学院试验动物中心提供的昆明种健康小鼠，雌性20只，雄性60只，体重18～25g。

　　1.2  主要试剂和仪器

    邻苯二甲酸二丁酯(分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司)；玉米油；环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司0.2g)；生理盐水。

    眼科剪刀及镊子、吸管、晾片架、注射器、灌胃针及针头、玻片、显微镜、计数器。

　　1.3  动物分组与处理

    昆明种小鼠40只，雌雄各20只，随机分为5组进行骨髓细胞微核实验，同时40只雄性小鼠也随机分为5组，进行精子畸形实验。两个试验均设DBP低、中、高染毒组及阳、阴性对照组，DBP用玉米油配制，剂量分别为500、1000、2000 mg/(kg·bw)，阴性对照组小鼠给予玉米油，阳性对照组小鼠给予环磷酰胺，剂量为40 mg/kg。阳性对照组采用腹腔注射染毒，其余剂量组采用灌胃染毒，注射量为0.20 mL/(10g·bw)，每天1次，连续5d。

　　1.4  观察指标

　　1.4.1  一般情况

　　在染毒期间，观察动物的活动、毛发、进食量、粪便及动物的体重变化。

　　1.4.2  小鼠骨髓微核试验
 
　　从小鼠染毒到第6天时，颈椎脱臼处死雌性小鼠，取两侧股骨用小牛血清冲洗骨髓制片，甲醇固定，10%Giemsa染色，每只小鼠计数1000个多染红细胞(PCE)中出现的微核细胞数，并各组的微核率(有微核的双核细胞数／1000个双核细胞)［5］。

　　1.4.3  小鼠精子畸形试验

　　从小鼠染毒到第35天时，颈椎脱臼处死雄性小鼠，取两侧附睾，在盛有0.5mL生理盐水的平皿中用眼科剪将附睾组织剪碎，用吸管轻轻吹打5～6次，制成精子悬液，用胶头滴管滴一滴于清洁玻片上，均匀推片晾干后，用甲醇固定5min，干燥后，用2%伊红水溶液染色至少2h，晾干后于高倍镜下观察；每剂量组小鼠检查完整无重叠的精子1600条，计数不同类型的畸形精子数目，精子畸形率(%)及畸形精子类型构成比［6］。

　　1.5  统计学方法

    采用SPSS 10.0统计软件建立数据库，本次实验数据采用单因素方差分析。微核、精子畸形出现频率呈现泊松分布，统计时进行平方根反正弦变换(arcsinP)使之变成或接近正态分布作t检验或方差分析［7］，相关结果作直线相关分析。

　　2  结果

　　2.1  一般情况

　　染毒后，高、中剂量组小鼠出现活动迟缓，大量出汗，但进食量略减少，在停止染毒后，上述症状逐渐消失。

　　2.2  微核试验结果
 
　　DBP染毒后第6天，各组小鼠骨髓细胞微核率见表1，中、高剂量组小鼠骨髓微核率明显高于阴性对照组(P＜0.05)。相关分析结果显示微核率与毒物剂量组有剂量-反应关系(r=0.937，P＜0.01)，且为正相关。表1  不同浓度的DBP对小鼠骨髓微核率的影响（略）

　　2.3  DBP对小鼠精子畸形率的影响

　　DBP染毒后第35天，各组小鼠畸形精子数见表2。与阴性对照组相比，DBP的低剂量组精子畸形率差异无统计学意义(P＞0.05)，中、高剂量组的精子畸形率均高于阴性对照组(P＜0.05)；中、高剂量组小鼠精子畸形率与低剂量组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。相关分析显示染毒剂量与小鼠精子畸形数有剂量-反应关系(r=0.904，P＜0.01)。表2  不同浓度的DBP对小鼠精子畸形率的影响（略）

　　3  讨论

    微核(micronucleus，MN)测定是一种简便快速的细胞遗传学检查方法，在诊断、预防肝癌、食管癌、肺癌等恶性肿瘤，评价药物、放射线及吸烟等细胞毒性物质对人、动物及体外细胞损伤程度有重要意义［8］，而微核的形成是细胞受遗传毒物作用后的一种遗传学终点［9］。本研究结果表明DBP可导致小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率升高，表明DBP能引起小鼠染色体丢失或断裂，是一种断裂剂，会引起可遗传的染色体畸变。提示在评价DBP安全性时必须考虑到它们对染色体的诱变作用以及由此而对人体健康造成的危害。

    精子畸形试验是检测化学毒物能否破坏哺乳动物精子正常形态的实验方法。正常情况下，哺乳动物的精液中也存在少量畸形精子，但在某些化学毒物的作用下，尤其是在可引起生殖细胞遗传性损伤的化学毒物作用下，哺乳动物睾丸产生的畸形精子数量会增加。一般来说生殖系统对邻苯二甲酸二丁酯的作用比其他系统较为敏感。

    本次试验结果显示，中、高剂量组的精子畸形率与阴性对照组比较明显增高，并呈现出明显的剂量-反应关系，提示DBP能干扰精子的生长、发育过程，导致精子发生障碍并引起小鼠精子畸形率明显增高。综上所述，DBP在一定浓度下对雄性小鼠生殖细胞具有致突变作用，说明DBP对雄性小鼠具有一定生殖毒性。

【】
  　　［1］CIRC(Cosmetic Ingredient Review Committee).Final report on the safety assessment of dibutyl phthalate，dimethyl phthalate，and dibutyl phthalate［J］. J Am Coll Toxicol，1985，4：267-303.

　　［2］刘慧杰，舒为群.邻苯二甲酸二丁酯生殖发育毒性研究进展［J］. 环境与健康，2004，21(2)：122.

　　［3］杨科峰，厉曙光，蔡智鸣，等.食用油及其油烟雾冷凝物中酞酸脂类化合物的测定［J］. 环境与职业医学，2002，19(1)：37-40.

　　［4］厉曙光，张敬，徐思红，等.家庭厨房油烟冷凝物化学成分及对果蝇经口染毒遗传毒性的研究［J］. 卫生研究，1999，28(1)：15-17.

　　［5］张驰，林辉，魏巍，等.多氯联苯和苯并(ａ)芘联合作用对 HepG2细胞CYP1A1和微核的影响［J］. 环境与健康，2007，2(24)：71.

　　［6］厉曙光，杨科峰.邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二辛酯对小鼠微核和精子的影响［J］.卫生研究，2006，35(2)：228.

　　［7］刘秀芳，刘桂珠.胡麻油烟冷凝物对小鼠生殖细胞的毒性［J］. 2003，19(2)：105-107.

　　［8］王昱，朱宇熹.微核的研究及应用［J］. 重庆医学，2003，32(5)：617.

　　［9］陈进军，于增杰.千里光提取物的小鼠骨髓微核试验［J］. 中兽医医学杂志，2007，(1)：20-22.