阿伦膦酸钠对骨髓生成破骨细胞骨吸收作用的影响

                 作者：陈明，郑琼，方真华，勘武生

【摘要】  ［目的］研究阿伦膦酸钠对体外培养的小鼠骨髓生成破骨细胞及其骨吸收作用的影响。［方法］收集小鼠骨髓细胞于含有10-8mol／L的1，25二羟基维生素D3［1,25-(OH)2D3］的α-MEM完全培养基中体外培养，设置不同浓度的阿伦膦酸钠给药，并于培养的第6、9、12 d观察记录抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)阳性多核巨细胞［破骨样细胞(osteoclast-like cell,OLC)］生成数，反映破骨细胞生成情况。记数培养12 d骨磨片上骨吸收陷窝数及吸收面积，反映骨吸收情况。［结果］随着阿伦膦酸钠浓度的增高，TRAP阳性的细胞数减少，骨吸收陷窝数及面积均减少。［结论］阿伦膦酸钠可抑制骨髓细胞体外培养中破骨样细胞的形成，体外可抑制破骨细胞骨吸收作用。

【关键词】  阿伦膦酸钠； 骨髓细胞； 破骨细胞； 骨吸收

    Abstract：［Objective］To study the effect of alendronate on bone resorption and osteoclast-like cells formation in mouse bone marrow culture.［Method］Marrow cells from kunming mouse were harvested and cultured in α-MEM with 10-8mol/L［ 1,25-(OH)2D3］. TRAP positive cells were recorded after 6,9 and 12 days exposure to various concentrations of alendronate in culture to reflect the formation of osteoclast-like cells. The number of bone resorption pits and area on bone slices  were counted to reflect the bone resorption at 12 days.［Result］TRAP positive cells, the number of bone resorption pits and area were reduced with the concentration increase of  alendronate. The inhabiting effect was dose dependent.［Conclusion］Alendronate has the inhabiting effects of oil bone resorption and the differentiation of bone marrow cells into osteoclast-like cells in vitro.

    Key words：alendronate;  bone marrow cells;  osteoclasts;  bone resorption

     人工关节置换技术日趋成熟，临床应用日益增多，但后期假体无菌性松动严重影响此类手术的远期效果。人工关节松动最重要的原因是假体周围骨溶解，在此过程中破骨细胞发挥着重要的作用。二膦酸盐能通过多种途径抑制破骨细胞的骨溶解作用，因而有望用于防治人工关节松动［1，2］。本实验通过观察阿伦膦酸钠对破骨细胞生成的影响，进一步认识阿伦膦酸钠在防治骨溶解中的作用机理，为其用于临床防治人工关节松动提供理论依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    本实验选用6～8周昆明小鼠(购自华中科技大学同济医学院动物中心)；1，25-(OH)2D3(Sigma)，α-MEM培养基(Sigma);胎牛血清(Gibco)；(萘酚AS-BI磷酸钠，六偶氮副品红，酒石酸钾钠)自配；阿伦膦酸钠由默沙东公司提供，薄骨片自行制备。

    TRAP孵育液的配制：孵育液A液，0.2 mol／L醋酸缓冲液，pH5.0；B液，六偶氮副品红，取副品红1 g加去离子水20 ml，浓盐酸5 ml，加热至90℃过滤制成副品红溶液，置于黑色瓶4℃储存，临用前与4％亚硝酸钠等比例混合；C液，取萘酚AS-BI磷酸盐20 mg加入N-二甲基甲酰胺1 ml溶解。取A液18 ml、B液1 ml、C液1 ml混匀，用1 mol／L氢氧化钠或盐酸调pH至5.0，加入酒石酸钾钠282 mg配成TRAP孵育液，过滤备用。

    薄骨片的制备：将新鲜牛股骨的皮质骨用钢锯及粗细金刚砂石制备成6 mm×6 mm大小，30 μm厚的骨磨片，骨蒸馏水中在超声波清洗仪内清洗3次，每次10 min。紫外线照射消毒，然后将骨片浸泡于α-MEM培养液内(含青霉素1 000 u／ml，链霉素1 000 μg／ml)，换液3次，每次20 min。

    1.2  骨髓细胞的收集培养

    参照［3］的方法，蒸馏水冲洗鼠体后颈椎脱臼处死小鼠，置于75％的酒精中浸泡3 min，无菌条件下取出四肢长骨，清除附着软组织，在冷的α-MEM分离液中，剪去骨干两端，用注射器针头吸取含1，25-(OH)2D3(10-8mol／L)的α-MEM完全培养基(15％的胎牛血清，青霉素100 u／ml，链霉素100 μg／ml，25 mmol／L HEPES)冲洗骨髓腔，筛网过滤，收集细胞悬液，按107／ml加入24孔培养板，37℃、5％CO2细胞培养箱培养，每2 d更换培养液。培养皿内预先加入骨磨片或多聚赖氨酸处理过的盖玻片。

    1.3  分组设计

    依据阿伦膦酸钠的不同浓度分为4组：对照组不加阿伦膦酸钠，3个实验组分别加入10-4mol/L,10-5mol/L,10-6mol／L的阿伦膦酸钠，其它培养条件相同。

    1.4  破骨细胞的观察、染色鉴定及计数

    用相差倒置显微镜观察培养皿内生成的破骨细胞形态及运动情况。见到明显的破骨细胞形态后做HE、TRAP染色鉴定及计数。HE染色：生长有细胞的盖玻片分别在6～12 d取出，2.5％戊二醛固定10 min，HE染色脱水，二甲苯透明、树胶封固，光镜观察。TRAP染色：用10％中性福尔马林固定15 min，将盖玻片置于TRAP孵育液中孵育50 min，蒸馏水冲洗后甘油明胶封片。光镜下观察含有2个细胞核以上染色阳性的多核巨细胞为破骨细胞。100倍光镜下任选10个视野，记录破骨细胞平均数。

    1.5  扫描电镜观察及骨片吸收陷窝面积测量

    骨片上的细胞培养1 d，2.5％戊二醛固定，扫描电镜观察。骨片吸收陷窝观察：细胞培养12 d取出骨片，于0.25 mol／L的氢氧化铵中超声清洗3次，每次5 min，2.5％戊二醛固定，经锇酸后固定，系列酒精脱水，醋酸异戊酯置换酒精，二氧化碳临界点干燥，镀金，扫描电镜观察骨片上的吸收陷窝，利用MPIAS-500图像分析系统进行吸收陷窝面积分析。

    1.6  统计学处理

    所有数据采用均数±标准差x±s表示，结果采用方差分析q检验，检测不同处理组之间TRAP染色阳性细胞数、骨吸收陷窝数及面积差异有无统计学意义。

    2  结  果

    培养6 d后对照组玻片上开始出现数目不等的多核巨细胞，相差显微镜下细胞形态清晰，呈油煎蛋形、长条形、漏斗形或不规则形，有片状或丝状伪足，这些细胞胞浆丰富，有几个到十几个细胞核，胞浆内可见大小不等的空泡，细胞形态会随着培养时间延长而变化。TRAP染色胞浆颗粒呈紫红色，经鉴定为破骨细胞(图1～3)。培养6 d 10-4mol／L组未见明显破骨样细胞，10-5mol／L和10-6mol／L组可见很少的破骨样细胞出现。第9、12 d玻片TRAP染色均可见数目不等的TRAP阳性细胞，但对照组OLC细胞远多于各实验组，且随着阿伦膦酸钠浓度的增高，TRAP染色阳性细胞呈递减趋势(表1)，两两比较显示，3个实验组TRAP阳性细胞数均明显少于实验组(P<0.01)，说明阿伦膦酸钠具有抑制骨髓生成破骨细胞的作用。表1  不同阶段各组TRAP染色阳性细胞记数注：*对照组比，P<0．01，△与10-6mol/L组比，P<0.05

    扫描电镜观察破骨细胞形态多样，与相差倒置显微镜所见一致，可见大而扁平的薄纱样伪足，细胞表面大量丝状突起。骨吸收陷窝呈圆形、椭圆形，底面粗糙，边界清晰(图4)。细胞培养12 d骨片吸收陷窝数与面积测量结果(表2)，不同浓度的阿伦膦酸钠均明显抑制破骨细胞对骨磨片的骨吸收。表2  阿伦膦酸钠对骨吸收陷窝与面积的影响注：*与对照组比，P<0.01

    图1～3  体外培养6 d，小鼠骨髓经1，25-（ＯＨ）２Ｄ３诱导生成破骨细胞，TRAP、HE染色鉴定及倒置相差显微镜下显示破骨细胞形态多样，胞浆丰富，有较多伪足 200×  图4  扫描电镜下观察到骨片吸收陷窝 1500×

    3  讨  论

    3.1  破骨细胞培养与鉴定

    破骨细胞由于数量少，体积大，含丰富蛋白水解酶并且有紧贴骨基质生长等特点，使得分离中破骨细胞易受损伤，获得较纯前破骨细胞难度较大，尤其是生化和分子生物学研究所需的大量高纯度破骨细胞更加困难。到目前为止，尚无具有成熟破骨细胞特征的细胞株，因此从骨组织分离或通过骨髓诱导是获得破骨细胞的主要途径。骨髓诱导破骨细胞过程中，1，25-(OH)2D3通过诱导骨髓中成骨／基质细胞合成巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和骨保护素配体(OPGL)2种因子，M-CSF同OPGL协同作用，可直接诱导人和小鼠体外破骨细胞的形成。此外，M-CSF可促进前破骨细胞表面OPGL受体表达，OPGL受体与其配体的相互作用介导成骨／基质细胞与前破骨细胞的直接接触，促进前破骨细胞分化为破骨细胞［4］。对于破骨细胞的鉴定，包括多核、多伪足，TRAP染色阳性，降钙素受体检测阳性，侵蚀骨片形成吸收陷窝等，本实验通过骨髓诱导培养破骨细胞，利用HE、TRAP染色及骨吸收陷窝观察进行鉴定，表明从骨髓诱导培养的多核细胞为破骨细胞。

    3.2  破骨细胞与骨溶解

    破骨细胞是骨组织中的多核细胞，位于骨组织表面的浅凹处。目前一般认为破骨细胞来源于骨髓中的单核巨噬细胞形成单位(GM-CFU)，其前体可能属于造血干细胞的前单核细胞，且由这些前单核细胞分化、融合而成。破骨细胞在骨的生长发育过程中，能不断吸收骨基质，与成骨细胞协同作用完成骨改建。其形成、功能受多种因素影响。目前已证实，1，25-(OH)2D3，甲状旁腺激素（PTH），前列腺素（PGE2），白介素（IL-1，IL-6）等通过直接或间接作用于成骨／基质细胞影响前体破骨细胞向成熟破骨细胞转化［５］。人工关节置换后期，单核巨噬细胞吞噬磨屑被激活，产生IL-１，IL-6，PGE2，TNF等溶骨因子，这些溶骨因子使破骨细胞活性增强，从而引起关节假体周围骨溶解，导致假体松动。因此，对破骨细胞生成及功能活化任一阶段进行阻断，应能阻止或降低人工关节后期骨溶解，减少人工关节松动发生的机会。

    3.3  阿伦膦酸钠对破骨细胞生成及骨吸收的影响

    阿伦膦酸钠是二膦酸盐的第3代产品，理化性质十分稳定，吸收后能迅速进入骨组织并吸附于羟基磷灰石晶体表面。二膦酸盐对破骨细胞的影响主要为：(1)可直接影响破骨细胞的活性；(2)可维持在足够大骨表面上的一个浓度梯度，进而直接影响其它细胞对破骨细胞的激活；(3)改变骨基质的活性，从而影响骨基质对破骨细胞的最终激活。以往有学者发现二膦酸盐可促进破骨细胞凋亡，抑制破骨细胞体外骨吸收［6］，但二膦酸盐对骨髓生成破骨细胞的影响，目前国内尚未见报道。Pandy等［7］报道在单核细胞与成骨细胞共同培养体系中加入二膦酸盐(EHDP)，可抑制单核细胞向破骨细胞转化，从而使破骨细胞数目减少。本实验发现，骨髓细胞体外培养中，加入阿伦膦酸钠抑制了1，25-(OH)2D3诱导的破骨细胞的形成，使破骨细胞生成数明显减少。随着阿伦膦酸钠浓度的增高，TRAP阳性的细胞数减少，而且还发现成熟的多核破骨细胞更少见，表明阿伦膦酸钠还抑制破骨前体细胞向成熟破骨细胞转化。这一现象的具体分子机制目前尚不清楚，可能是通过干扰破骨细胞生成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF)及破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor,ODF)之间的平衡而发挥作用。本实验还发现，阿伦膦酸钠对骨髓诱导的小鼠破骨细胞骨吸收作用起抑制作用，随浓度增加而抑制作用增强，表现为骨吸收陷窝数目及吸收面积减少，原因可能为:(1)阿伦膦酸钠抑制小鼠骨髓生成破骨细胞，从而使发挥作用的破骨细胞数减少;(2)培养液中的阿伦膦酸钠抑制破骨细胞聚集在骨表面，使其不能对骨矿发挥作用；(3)使骨面上的破骨细胞活性受抑制；(4)加快破骨细胞凋亡，使其作用时间缩短。

    总之，阿伦膦酸钠可抑制鼠骨髓细胞体外培养中破骨细胞的形成，抑制破骨细胞的骨吸收作用，在细胞水平上为其用于临床防治人工关节松动提供了一定的理论依据。

【】
  ［1］ Iwase M，Kim KJ，Kobayashi Y，et al．A novel bisphosphonate inhibits inflammatory bone resorption in a rat osteolysis model with continuous infusion of polyethylene particles［J］．J Orthop Res,2002，20(3)：499-505．

［2］ 陈 明，夏仁云．二磷酸盐对关节磨屑刺激单个核细胞表达ＩL-6m RNA的影响［J］．矫形外科杂志，2004，12(6)：447-449．

［3］ 李铁军，于世凤，王晓敏，等.1，25二羟基维生素D3对小鼠骨髓细胞形成破骨样细胞及其骨吸收效应的影响［J］.中国骨质疏松杂志，2000，6(3)：12-15.

［4］ Julian MWQ, Wlliott J,Gillespie MT, et al. A combination of osteoclast differentiation factor and macrophage-colony stimulating factor is sufficient for both human and mouse osteoclast formation in vitro［J］. Endocronology, 1998,139:4424-4427.

［5］ Fujikawa Y, Sabokbar A, Neale SD, et al. The effect of macrophage-colony stimulating factor and other humoral factors (interleukin-1, -3, -6, and -11, tumor necrosis factor-a, and granulocyte macrophage-colony stimulating factor) on human osteoclast formation from circulating cells［J］. Bone, 2001, 28(3):261-267.

［6］ Afsaneh S, Yosuke F, David W M, et al. Bisphosphonates in bone cement inhibit PMMA particle induced bone resorption［J］. Ann Rheum Dis, 1998, 57:614-618.

［7］ Pandy R, Quinn J, Sabokbar A, et al. Bisphosphonate inhibition of bone resorption by particulate biomaterial-associated macrophages［J］. Acta Orthop Scand,1996, 67:221-228.