转录因子T-bet，GATA-3对食管癌患者免疫状态的影响
【摘要】 目的： 研究食管癌患者转录因子T-bet，GATA-3的基因表达及其对患者免疫状态的影响。方法： 根据其CT分期将40例食管癌患者分为两组：一组为第Ⅰ，Ⅱ期患者，另一组为第Ⅲ，Ⅳ期患者；荧光定量PCR技术检测40例食管癌患者及20例健康对照者外周血单核细胞T-bet，GATA-3 mRNA的表达水平；ELISA法检测血浆中辅助性T细胞1型(Th1)细胞因子IFN-γ及辅助性T细胞2型(Th2)细胞因子IL-4。结果： 食管癌组较对照组T-bet mRNA表达明显降低，GATA-3 mRNA表达明显升高，IFN-γ表达明显降低，IL-4表达明显升高，不同期别食管癌组间差异不显著。T-bet，GATA-3分别与IFN-γ，IL-4呈正相关。结论： 食管癌患者Th1型细胞因子表达降低，Th2型细胞因子表达升高，即Th1/Th2平衡被打破，发生了向Th2方向的漂移，免疫功能受损；这种改变受到转录因子T-bet，GATA-3的调控，T-bet表达的减少在这种调控中可能起着关键的作用。
【关键词】 食管癌； 转录因子； 细胞因子； T-bet； GATA-3
［Abstract］ Objective: To evaluate the expression of transcription factors T-bet/GATA-3 mRNA in patients with esophageal carcinoma and their influence on those patients′ immunity.Methods： According to CT image,patients were divided into two groups, stage I plus II, and, stage Ⅲ plus Ⅳ; The gene expression of T-bet/GATA-3 in patients with esophageal carcinoma and control group was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction RT-PCR.The expression of IFN-γ and IL-4 for Th1/Th2 cytokine was measured by ELISA. Results： T-bet mRNA expression of esophageal carcinoma was significantly lower than that in control, the expression of GATA-3 mRNA in esophageal carcinoma was significantly enhanced. The plasma level of Th1 cytokine IFN-γ in esophageal carcinoma was significantly lower than that in control.The level of Th2 cytokine IL-4 in esophageal carcinoma was significantly higher than that in control. However，the difference between two groups was not significant. Conclusion： In patients with esophageal carcinoma, we found there were lower production of IFN-γ for Th1 and over-production of IL-4 for Th2,which meant there was imbalance between Th1 and Th2.The change that the imbalance differentiation of Th cells was regulated by T-bet and GATA-3,and the less T-bet expression may be a more important factor.
［Key words］ esophageal carcinoma； transcription factors； cytokines； T-bet； GATA-3
食管癌是许多国家和地区常见的恶性肿瘤，而我国更是世界上食管癌死亡率最高的国家，近20年来，食管癌的有了很大的进展，但传统的手术、化疗和放疗仍未取得理想的疗效，其5年生存率仅10%左右。近年来，肿瘤的免疫学研究取得了较大的进展，众多研究表明肿瘤患者呈现Th2漂移现象，而机体的抗肿瘤效应以Th1为主，因此，如何逆转Th2漂移成为当前的研究热点。T-bet是哈佛大学Glimcher研究小组于2000年分离出的T-box家族的新型转录因子［1］，因其仅表达于T细胞而得名(T box expressed in T cells)，是调控细胞因子发育的关键因子,对机体内细胞因子的发育和细胞因子间的平衡都起到非常重要的作用［2］。研究他们之间的关系，有助于调整肿瘤患者的免疫状态，使机体向有利于抗肿瘤的方向。目前，就所查的，食管癌患者转录因子与细胞因子间的关系尚未见报道。为此，我们检测了20例健康对照组及40例食管癌患者血浆中Th1，Th2 两类细胞因子的表达水平及外周血单个核细胞的转录因子T-bet，GATA3基因表达水平。以探讨食管癌患者的细胞免疫状态，及转录因子对其的调节作用。
1 资料与方法
1.1 临床资料
40例食管癌患者均为2006年10月～2007年10月在江苏大学附属住院患者，其中男27例，女13例；年龄45～80岁，平均61岁。所有患者经胃镜检查并取组织病理检查证实为食管鳞癌，并根据食管癌CT分期［3］将患者分为两组，一组为第Ⅰ,Ⅱ期患者，共16例；另一组为第Ⅲ,Ⅳ期患者，共24例。所有患者无其他系统疾病，近2个月内未使用过皮质激素或其他免疫制剂，未经手术、放疗、化疗、中药等治疗。对照组为同期在我院门诊查体的健康人20例，年龄、性别与研究组匹配。
1.2 方法
1.2.1 试剂和仪器 淋巴细胞分离液（Ficoll-泛影葡胺）购自天津TBD公司；Trizol购自Invitrogen公司，T-bet,GATA-3及β-actin引物序列由广州达晖生物公司设计并合成，SYBR Green PCR试剂盒购自达晖生物公司，IFN-γ及IL-4酶联免疫吸附法检测试剂盒为武汉博士得公司生产。Real-time检测仪(7300 Sequence Detection System)为美国ABI公司生产，型号ABI-7300。酶标仪，规格型号：HT2。
1.2.2 标本的收集与处理 抽取食管癌患者及健康对照者空腹外周静脉血各5 ml，并以EDTA抗凝，2 000 r/min，15 min，分离出血浆冻存待测。同时用淋巴细胞分离液常规分离出单核细胞，并加1 ml Trizol震荡混匀后冻存于-70℃备用。
1.2.3 转录因子T-bet和GATA-3 mRNA表达水平的检测 RT-PCR法检测，T-bet,GATA-3及β-actin的引物序列和扩增长度见表1。步骤如下：提取总RNA-逆转录cDNA-RT-FQ-PCR反应。PCR扩增体系总体积50 μl：SYBR Green Mix 32.5 μl,上游引物0.5 μl,下游引物0.5 μl,ddH2O 14.5 μl,cDNA模板2 μl。反应条件为：95℃预变性15 min；95℃变性20 s,55℃退火30 s,72℃延伸10 s,共循环40次。数据采用仪器自带软件（ABI Prism 7300 SDS Software）分析。
1.2.4 细胞因子IL-4和IFN-γ表达水平的测定 采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书操作。
表1 T-bet,GATA-3和β-actin引物序列（略）
Tab 1 Primer sequence of T-bet，GATA-3 and β-actin
1.3 统计方法
采用SPSS10.0进行数据处理，结果以x±s表示,经方差齐性检验后, 组间差异采用方差分析；相关性采用直线相关分析，以P<0.05为差异有统计学有意义。
2 结果
2.1 外周血血浆中IFN-γ,IL-4水平
Ⅰ,Ⅱ期及Ⅲ,Ⅳ期食管癌患者外周血血浆中IFN-γ表达水平较正常对照组降低（P<0.05）,IL-4表达水平较正常对照组升高（P<0.05）,但两食管癌组间IFN-γ,IL-4水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2 食管癌组和对照组血浆中IFN-γ,IL-4水平（略）
Tab 2 Secretion of cytokines IFN- γ, IL-4 in serum in esophageal carcinoma and control groups
与对照组比较, ▲：P<0.05；与Ⅰ,Ⅱ期比较，*：P>0.05
Ⅰ,Ⅱ期及Ⅲ,Ⅳ期食管癌患者外周血单核细胞中T-bet mRNA表达较正常对照组降低（P<0.05）, GATA-3 mRNA表达较正常对照组升高（P<0.05）,但两食管癌组间T-bet mRNA,GATA-3 mRNA差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
表3 食管癌和对照组外周血单核细胞中T-bet mRNA,GATA-3 mRNA表达水平（略）
Tab 3 Expression of T-bet mRNA and GATA-3 mRNA in PBMCs ofesophageal carcinoma and control groups
与对照组比较，▲：P<0.05；与Ⅰ,Ⅱ期比较, *：P>0.05
2.3 细胞因子IFN-γ,IL-4水平与转录因子T-bet mRNA,GATA-3 mRNA相关性分析
食管癌组IFN-γ水平与T-bet mRNA表达呈正相关（r=0.69，P<0.05）,与GATA3 mRNA呈负相关（r=-0.37，P<0.05）；IL-4与T-bet mRNA表达呈负相关（r=－0.60，P<0.05），与GATA3 mRNA表达呈正相关（r=0.41，P<0.05）。
3 讨论
T-bet是Th1型细胞因子的特异转录因子。Szabo等［1］认为，T-bet既可通过激活转录因子STAT1介导IFN-γ基因的转录，诱导自身再表达T-bet，又可上调自身细胞表达IL-12 Rβ2，以增强对IL-12的敏感性，加速向Th1细胞分化。最新研究表明T-bet还可以下调IL-4的转录，从而将Th2型逆转为Th1型［4］。也有学者认为其机制可能是T-bet直接抑制了GATA-3的作用［5］。GATA-3是Th2特异的转录因子,是所有Th2型细胞因子转录所必需的［6］,能促使分化中或已分化的Th细胞合成Th2细胞因子［7］。在生理条件下,机体Th1/Th2细胞的免疫功能处于动态平衡状态, 研究表明，这种平衡的偏离,即向Th1或Th2漂移，与多种疾病的发生、和预后有关。而T-bet,GATA-3是目前较为关注的调控Th1/Th2分化平衡的一对转录因子。
在本研究中，我们发现食管癌患者外周血单核细胞低表达T-bet，高表达GATA-3，且从其改变的程度来看，T-bet基因水平的降低更为显著；同时外周血血浆中呈现出以Th2型细胞因子IL-4占优势的现象，Th1型细胞因子IFN-γ则较正常对照组明显降低；直线相关性分析证实了Th1,Th2细胞因子的变化分别与T-bet,GATA-3的基因表达变化呈正相关。因此我们推测，T-bet低表达,GATA-3高表达，尤其是前者使得食管癌患者出现了Th2漂移，导致机体细胞免疫功能降低，不利于以细胞免疫为主的抗肿瘤免疫反应,使肿瘤细胞得以生存发展，而且这种变化趋势在分期较晚（Ⅲ,Ⅳ 期患者）的食管癌组中更加明显。但在不同期别食管癌组间，T-bet表达降低、GATA-3表达升高的趋势虽随着分期愈晚而愈明显，但并无显著统计学意义，这尚有待国内外学者的进一步证实。
许多研究表明，肿瘤患者Th2占优势，这种优势状态与肿瘤的免疫逃逸有密切关系,其机制尚未十分清楚。现已发现非小细胞肺癌［8］、直肠癌［9］、前列腺癌［10］等多种肿瘤与Th2漂移密切相关,且与肿瘤的恶性程度呈正相关。亦曾有研究报道食管癌患者体内同样出现了Th2漂移现象［11］，这与本研究结果一致，且我们进一步从更高的层面——转录因子水平来研究患者的细胞免疫状态。在抗肿瘤免疫反应中,Th1细胞主导机体的细胞免疫功能,分泌Th1类细胞因子,对抗肿瘤免疫反应非常重要, 从免疫学角度来说, 我们希望肿瘤患者Th1占优势, 以逆转细胞免疫功能不足的现象, 发挥抗肿瘤效应。因此，在临床中，若以调控辅助性T细胞分化的转录因子T-bet和GATA-3为靶点,使T-bet/GATA-3 趋向平衡,从而调整失衡的Th1/Th2,使其重新达到平衡，这或许可以为食管癌的免疫治疗提供一种新的方法。此外，在临床工作中通常需检测两类细胞因子的表达来了解患者的免疫状态，而根据本研究的结果，我们可用检测T-bet/GATA-3的表达这种更为简单可行的方法来代替，可能同样可以达到了解患者免疫状态的目的。但是由于本研究样本数较小，结论（尤其是不同期别食管癌组间有无差别）尚有待进一步证实；在今后的研究中，我们将对实验组的患者进行随访，以探讨T-bet/GATA-3的表达水平与患者的病情变化、预后以及生存率等之间的关系；并着重于研究以T-bet/GATA-3为靶点，寻找有效的治疗途径，以期为肿瘤患者提供一个有效的治疗方法。
【】
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［4］ 张熙曾.食管癌［M］.北京：北京大学医学出版社，2006：41.
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