丙泊酚对大鼠缺血再灌注肾NF?κB、TNF?α表达的影响

【摘要】  目的 研究丙泊酚对大鼠肢体缺血再灌注损伤后肾组织中肿瘤坏死因子?α(tumor necrosis factor?α，TNF?α)、核因子?κB(nuclear factor?κB，NF?κB)表达的影响。方法 24只SD雄性大鼠，随机分为假手术对照组(A组)，肢体缺血再灌注组(B组)和丙泊酚干预组(C组)，每组8只。采用免疫组织化学方法检测TNF?α、NF?κB的表达，行图像分析半定量。结果 B组大鼠肾组织中TNF?α、NF?κB的表达明显高于A组(P＜0.05)，C组明显低于B组(P＜0.05)。结论 肢体缺血再灌注后有明显肾损伤，丙泊酚对肢体缺血再灌注肾损伤有一定程度的保护作用，其机制可能与下调大鼠肢体缺血再灌注损伤肾组织中TNF?α、NF?κB的过度表达有关。
　　

【关键词】  丙泊酚；肾；肢体缺血再灌注；肿瘤坏死因子?α；核因子?κB

　　肢体缺血再灌注损伤是外科常见的病理生理过程，如止血带使用时间过长、创伤、断指再植、血栓再通等都可以引起肢体缺血再灌注损伤。肢体缺血再灌注除了能引起相应的肢体损伤，还可以通过神经?内分泌?免疫机制引发远隔脏器障碍及损伤。肢体缺血再灌注对相应肢体损伤的研究已较成熟，但对于肢体缺血再灌注引起的远隔脏器肾损伤的研究却较少见。本研究拟观察大鼠肢体缺血再灌注后肾组织中肿瘤坏死因子?α(tumor necrosis factor?α，TNF?α)、核因子?κB(nuclear factor?κB，NF?κB)的变化以及丙泊酚对其损伤的干预。

　　1  资料与方法

　　1.1  动物模型制备  实验前禁食12 h，自由饮水，25％乌拉坦(1 g/kg)腹腔注射，麻醉后气管切开，接动物呼吸机机械通气(通气频率为75次/min，潮气量为8 mL，吸呼比为1∶2)，于腹股沟处解剖出双侧股动脉，用无创动脉夹夹闭，远端股动脉置管测压，血压为零标志缺血成功，保持下肢缺血3 h后去除动脉夹再灌注4 h，恢复下肢血供，血压升高标志再灌注成功。

　　1.2  分组及处理  24只清洁级SD雄性大鼠(山西医科大学动物中心提供)，体重(200±20) g，随即分为三组，每组8只。假手术对照组(A组)：大鼠麻醉后仅分离不夹闭股动脉；肢体缺血再灌注组(B组)：夹闭股动脉缺血3 h，再灌注4 h；丙泊酚干预组(C组)：夹闭股动脉前10 min静脉注射丙泊酚5 mg/kg(AstraZeneca公司，英国)，随后以10 mg/kg·h静脉输注，缺血再灌注同B组。再灌注完毕，实验动物经心脏主动脉插管灌注固定液〔4％多聚甲醛0.1 mmol/L磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)配制〕后，处死大鼠取肾，置于10％甲醛溶液中固定24 h后常规石蜡包埋并切片，以备组织学检查。

　　1.3  肾组织TNF?α、NF?κB的检测  选用链酶亲和素?过氧化物酶复合物即用型免疫组化试剂盒(武汉博士德)，按说明书操作，取石蜡片按程序脱蜡，3％H2O2灭活内源性酶，微波抗原修复10 min，5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封闭，分别加免抗TNF?α多克隆抗体(武汉博士德)I抗、免抗NF?κBp65多克隆抗体(武汉博士德)I抗，稀释度为1∶80，冰箱过夜后加山羊抗鼠免疫球蛋白G，加酶标记物，DAB显色，光镜下观察。应用Laica图像分析系统，光镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统。每张切片随机选取60个区域，每张切片的平均光度，阳性单位。

　　1.4  统计分析  计量数据以(±s)表示，统计分析采用SPSS12.0行方差分析和q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2  结    果

　　2.1  肾组织病观察  光镜下，A组无明显病理学改变，B组可见肾小球肿大，球囊上皮细胞肿胀，囊壁水肿，囊腔变小。间质内少量中性白细胞浸润，血管内白细胞聚集，靠边。C组肿大肾小球明显减少，囊壁水肿亦减轻，囊腔较B组变大。A组肾组织有较少量的TNF?α、NF?κB的蛋白表达，B组肾组织中TNF?α、NF?κB的表达比A组显著上调(P＜0.05)，但C组大鼠肾组织中TNF?α、NF?κB表达明显低于B组(P＜0.05)(见表1)。光镜下观察各组蛋白表达变化，见图1～4。

　　表1  各组大鼠肾组织TNF?α、NF?κB的表达  (略)

　　图1  －　图4  略

　　3  讨    论
　　
　　缺血再灌注损伤是常见的病理生理过程，越来越受到重视和研究。肢体缺血再灌注损伤的机理极为复杂：无复流导致一系列细胞结构、功能障碍；钙超载导致离子交换变化，能量代谢障碍；中性粒细胞活化引发“呼吸爆发”，产生并释放大量自由基和一些促炎症细胞因子，如NF?κB、TNF?α等，造成组织损伤和血管通透性增加；以及自由基损伤作用等，从而引起全身炎症反应。TNF?α是一种具有多种生物学活性的细胞因子，主要来源于单核细胞和巨噬细胞。正常水平的TNF?α可以参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复，引起肿瘤细胞凋亡等，但TNF?α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起使机体产生多种病理变化，例如恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、移植物宿主病等［1］。实验证明，TNF?α是重要的炎症促进因子并参与多种组织再灌注损伤。TNF?α能刺激血管内皮细胞和中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophils，PMN)表达表面粘附分子，促进PMN聚集，有助于PMN释放活性氧和蛋白水解酶等物质，加重缺血再灌注损伤程度［2］。此外，TNF?α能刺激诱导型一氧化氮复合酶合成释放大量的NO，后者又与超氧阴离子迅速反应，进一步产生氧化能力更强的过氧亚硝基，可使细胞膜产生脂质过氧化，致使组织损伤加重［3］。本实验显示，肢体缺血再灌注后肾组织中TNF?α表达明显增加，说明肢体缺血再灌注对肾脏有明显的损伤。光镜下观察肢体缺血再灌注组肾损伤明显，也进一步说明了这一点。NF?κB是一种多极性的具有基因转录调控作用的蛋白质因子，在未受刺激时，细胞质中NF?κB与抑制蛋白I?κB结合处于非活化状态，受到刺激时I?κB被降解并与NF?κB解离，NF?κB进入细胞核与特异的启动子结合，调节基因表达［4］。NF?κB能调节许多与免疫和炎症相关的促炎症介质的基因转录和表达，亦能调节多种参与缺血再灌注损伤的细胞因子、黏附分子的基因转录过程，从而控制它们的生物合成［5］。NF?κB作为一种重要的核转录因子，它能影响调节TNF?α等细胞因子及粘附分子的基因表达，而这些物质都能直接或间接地参与肠缺血再灌注(intestinal ischemia reperfusion，IIR)损伤。Haseoun等［6］发现IIR后NF?κB的活性显著性升高。Zou等［7］也发现IIR通过NF?κB依赖性机制诱导细胞间粘附分子?1表达，可直接引起血管内皮细胞和肠上皮细胞损伤，而抑制NF?κB的活化，可减轻肠粘膜的损伤程度。证实了缺血再灌注后NF?κB的表达增加，同时可以观察到肠膜损伤加重，提示NF?κB激活后通过调控细胞因子和粘附分子等蛋白的表达而参与再灌注损伤的发生过程。NF?κB的不适当激活是引起过度炎症反应及炎症损伤的关键因素，从而可加重急性炎症反应［8］。NF?κB的激活可增强TNF?α，白细胞介素?1的转录，TNF?α，白细胞介素?1水平的升高可进一步增高NF?κB的激活，作用是增强炎症信号。实验显示，肢体缺血再灌注后肾组织中NF?κB表达亦明显增加，进一步说明肢体缺血再灌注对肾脏有明显损伤。光镜下观察肢体缺血再灌注组肾损伤明显，进一步说明了这一点。丙泊酚是一种起效快、代谢快静脉麻醉药，长时间镇静后苏醒迅速，醒后无定向障碍，临床广泛用于静脉麻醉和镇静催眠。它与内源性抗氧化剂?生育酚和已知的抗氧化剂丁羟基甲苯，在化学结构上相似，该结构可与自由基反应并使之灭活，抑制自由基引起的一系列过氧化损伤；调节炎性细胞趋化因子，减少炎性细胞聚集进而减轻炎性细胞对机体的损伤；抑制一氧化氮复合酶活性，清除过氧亚硝基阴离子；抑制中性粒细胞的呼吸爆发，降低氧自由基的产生；通过阻断L型电压敏感型钙通道，减少跨肌膜钙离子内流，减轻钙超载，进一步抑制炎症因子TNF?α的表达，从而减轻细胞损伤。已有研究显示，丙泊酚具有减少心肌缺血再灌注后NF?κB过度表达的作用。本研究显示，光镜下观察丙泊酚干预组较肢体缺血再灌注组肾损伤明显减轻，丙泊酚干预组肾组织中TNF?α、NF?κB的表达亦明显减少，证明丙泊酚可降低大鼠肢体缺血再灌注损伤后肾组织中TNF?α、NF?κB的表达，从而减轻肾损伤，起到保护肾功能的作用。综上所述，肢体缺血再灌注后肾组织有明显损伤，TNF?α、NF?κB表达增高，丙泊酚具有抑制TNF?α、NF?κB过度表达的作用，从而对肢体缺血再灌注肾损伤起到保护作用，进一步说明，丙泊酚是手术中值得推荐的静脉麻醉药。

【】
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