褪黑素对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

【摘要】  观察褪黑素(melatonin，MT)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后脊髓组织细胞凋亡的影响，探讨其对脊髓损伤的保护作用。方法 成年Wister大鼠66只，随机分为三组：Sham组(假手术组)、A组(单纯SCI组)及B组(MT组)。Sham组仅切除椎板未损伤脊髓；A、B两组采用改良Allen法制成大鼠SCI模型，术后立即分别腹腔注射等体积无水乙醇、褪黑素(100 mg/kg)；Sham组于术后48 h、A和B组于术后8、24、48、72 h和7 d分别进行神经功能评分和测定伤段脊髓组织凋亡细胞数。结果 A组凋亡细胞百分率伤后24 h开始升高，48 h达到高峰，72 h开始下降；B组凋亡细胞百分率伤后24 h、48 h及72 h与A组相比明显减少，差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)；B组神经功能比A组有明显提高(P＜0.05)。结论 SCI后应用MT可以抑制脊髓组织神经细胞凋亡，从而对脊髓损伤起保护作用。

【关键词】  褪黑素 脊髓损伤 细胞凋亡

   Effects of Melatonin on Rat Neurons Apoptosis After Spinal Cord Injury

    Abstract：Objective  To observe the effect of melatonin(MT) on rat neural cell apoptosis after experimental spinal cord injury(SCI) in order to study the protective effect on SCI.Methods  Sixty?six Wister rats were randomly divided into 3 groups：sham group(no spinal cord injury )，group A (SCI group) and group B(MT group).Sham group only cut vertebral plate without spinal cord injury.The SCI model was induced using the modified Allen technique in group A and B.The rats were treated with MT(100 mg/kg) in group B and the dehydrated alcohol of equal volume in group A after SCI.Apoptosis and nerves function were measured at 8 h、24 h、48 h、72 h and 7 d following SCI in group A and B，while Sham group was at 48 h.Results  Cell apoptosis rate was increased at 24 h，reached their peaks at 48 h and descended 72 h after injury in group A.The apoptosis rate in group B was significantly decreased as compared with group A at three time points(P＜0.05 or P＜0.01)，and the functional recovery was better in group B than in group A.Conclusion  MT can inhabit rat neural cell apoptosis after SCI.It has protective effect on acute SCI.

    Key words：melatonin；spinal cord injury；apoptosis

    本实验旨在观察褪黑素(melatonin，MT)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后脊髓组织神经细胞凋亡的影响，探讨其对脊髓损伤的保护作用，现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  动物分组  健康成年Wister大鼠(苏州大学实验动物中心提供)66只，体重220～300 g，雌雄不限，随机分为三组：假手术组(Sham组)6只，单纯SCI组(A组)及MT治疗组(B组)各30只。A、B两组又按SCI后不同时间点(8、24、48、72 h和7 d)各分为5个亚组，每个时间点6只。

    1.2  模型制备与处理  以10％水合氯醛(400 mg/kg体重)腹腔注射麻醉。严格无菌操作下取正中切口，切除T8～10椎板，暴露硬膜囊并保持其完整。Sham组仅切除椎板暴露硬膜，未损伤脊髓；A、B两组按照改良Allen法制作中度脊髓损伤模型。B组于SCI后30 min内腹腔注射MT溶液(100 mg/kg体重，购自晶美上海公司，瑞士Alexis公司生产)，按照褪黑素说明书要求，用无水乙醇对褪黑素进行稀释；A组于同一时间内给予等量无水乙醇。术后常规青霉素40万U肌肉注射，1次/d；人工排尿，2次/d。

    1.3  检测指标及方法  A和B组分别于术后8、24、48、72 h和7 d随机各取6只，用4％水合氯醛麻醉，从原切口暴露脊髓，以损伤处为中心迅速取出伤段脊髓组织约25 mm，将标本用冰生理盐水洗净表面血迹，滤纸吸干水分后制备成匀浆，测定凋亡细胞数。Sham组6只全部于伤后48 h取髓。细胞凋亡用Annexin V?PI双标记流式细胞仪检测，分别于488 nm激发波长和560 nm波长以EPICSELite流式细胞仪检测Annexin V和PI标记的细胞，以不含Annexin V和PI的孵育缓冲液的脊髓细胞作阴性对照，凋亡细胞百分率。

    1.4  神经功能评分  A、B及Sham组在各时间点取髓前平行观察斜板试验与BBB评分，两者同时进行。 a)斜板试验：大鼠SCI后观察各组脊髓功能恢复情况，大鼠肢体抓握能力与斜板角度成正比，反映其脊髓功能恢复情况。b)BBB评分：左右两肢取平均值，作为每只大鼠每次神经功能评定的得分，BBB评分联合考察大鼠后肢的运动、躯干位置及稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置。

    1.5  统计学分析  实验数据用±s表示，用SPSS 11.0软件包处理数据，采用方差分析进行组间差异分析。

    2  结    果

    2.1  细胞凋亡检测结果  细胞凋亡流式细胞仪检测结果见表1。Sham组未见凋亡细胞；A组凋亡细胞百分率伤后24 h开始升高，48 h达高峰，72 h开始下降；B组凋亡细胞百分率伤后24 h、48 h及72 h与A组相比明显减少，差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。

    2.2  脊髓功能恢复比较  Sham组的脊髓神经功能稳定，其斜板试验角度和BBB评分在SCI后 24 h分别达到60°和20分左右，表现基本正常。和A组相比，MT组神经功能恢复均有不同程度提高。其中，MT治疗组斜板试验可以观察到运动功能总的提高，至第3天和第7天，运动功能提高，差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，见表2。同时MT治疗组BBB评分也有不同程度的提高，至SCI后3、7 d，两组之间差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，见表3。表1  MT对SCI后伤段脊髓组织细胞凋亡的影响 表2  MT对大鼠SCI后斜板试验的影响 表3  MT对大鼠SCI后BBB评分的影响

    3  讨    论

    报道急性脊髓损伤后细胞凋亡对神经细胞的继发性损害起重要作用［1］。褪黑素是存在人体内的重要神经内分泌活性物质，具有高度的脂溶性和水溶性，能透过细胞膜和核膜进入细胞内和核内发挥作用。研究已证实褪黑素可以抑制大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织内丙二醛、一氧化氮合酶等自由基的产生，提高脊髓组织超氧化物歧化酶的含量，减少脊髓损伤后的自由基损害［2～3］，而褪黑素对SCI后神经细胞凋亡的影响未见报道。

    本实验结果显示，单纯脊髓损伤组(A组)凋亡细胞百分率伤后24 h开始升高，48 h达高峰，72 h开始下降，表明脊髓损伤后细胞凋亡活跃，参与了对脊髓组织的损害。MT治疗组(B组)凋亡细胞百分率伤后24、48、72 h与A组相比明显减少，差异具有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01)，表明脊髓损伤后早期应用MT可以抑制脊髓组织神经细胞凋亡。同时神经功能评分也观察到MT治疗明显提高了SCI大鼠的脊髓恢复功能，直接证实其对脊髓损伤有保护作用。急性脊髓损伤后自由基积聚，清除能力下降，处在一种氧化应激状态，这种氧化应激能诱导神经细胞凋亡［4］，褪黑素能直接清除自由基，减轻氧化应激损害，从而推测褪黑素可能是通过抑制脊髓损伤后的自由基损害这一途径来减少神经细胞凋亡。

    本实验证实急性脊髓损伤后，早期应用褪黑素可以抑制脊髓组织神经细胞凋亡，从而对脊髓损伤起保护作用。

【文献】
  ［1］傅强，侯铁胜，鲁凯伍，等.大鼠脊髓急性损伤后神经细胞的凋亡［J］.中华创伤杂志，2001，17(4)：31?33.

［2］Erten SF，Kocak A，Ozdemir I，et al.Protective effect of melatonin on experimental spinal cord ischemia［J］.Spinal Cord，2003，41(10)：533?538.

［3］逯强，杨军，赵洪波，等.褪黑素对大鼠急性脊髓损伤的保护作用［J］.中华创伤杂志，2006，22(5)：382?383.

［4］Tao L，Gao E，Hu A，et al.Thioredoxin reduces post?ischemic myocardial apoposis by reducing oxidative/nitrative stress［J］.Br J Pharmacol，2006，149(3)：311?318.