光动力疗法细胞死亡作用机制的相关影响因素 及其在结直肠肛门外科中的应用
1 光动力学疗法的基本原理
光动力学疗法的基本要素是氧、光敏剂和光,利用内源性或外源性光敏剂在组织中有选择性分布特点，当光敏剂在目标靶组织与非目标靶组织中的浓度比达到最大值时,应用有效光源激发，就可产生一系列光化学、光生物反应，达到引起细胞死亡/凋亡、血供破坏、甚至组织坏死等治疗目的。在光动力反应过程中，可产生多种活性氧物质（ROS），包括单线态氧（1Ｏ2）、超氧阴离子自由基（Ｏ2-）、羟基自由基（.ＯＨ）等，其中单线态氧起主要作用。
2 光动力学疗法中细胞死亡机制的影响因素
2.1 组织氧浓度
氧是PDT不可缺少的因素，组织适量的氧浓度有助于保证PDT的治疗效率，但缺氧或高氧对PDT抗肿瘤效应影响如何目前仍然有争议。Hjelde 研究显示，缺氧并没有减弱PDT对人源性结肠癌SW480 、WiDr细胞株及鼠膀胱细胞癌AY?27细胞株的脂质过氧化作用，单独暴露在400 kPa高氧环境下也没有增强上述作用[1]。在P338鼠肿瘤模型研究中，以金丝桃素为光敏剂，应用肼苯哒嗪与尼克酰胺分别造成肿瘤乏氧和富氧状态，这两种状态对不同条件的PDT实验均没有产生影响[2]。Wyld以ALA为光敏剂对膀胱癌细胞在不同氧压条件下进行研究，结果发现缺氧使原卟啉Ⅸ合成减少，削弱了PDT对癌组织的杀伤效应，Huang 利用高压氧技术改善肿瘤缺氧状况后，却能明显提高 PDT对癌细胞的杀伤率[3,4]。尽管上述实验研究结果不一致，但大多数实体瘤呈缺氧状态却是不争的事实，而PDT不仅破坏肿瘤血管，又会消耗一定量的氧，使肿瘤内部缺氧加重并造成空间分布不均匀，因此，实体瘤乏氧与PDT效应之间的矛盾关系以及改善措施等问题值得进一步深入去探讨。
2.2 光敏剂
在光动力学疗法中，光敏剂是首要因素，光敏剂的优劣直接与疗效相关，影响着细胞死亡的各个环节。在角质化HaCaT细胞株体外实验中，二氢卟酚e6的杀伤能力是脱镁叶绿甲酯酸a的5倍[5]；卟啉和二氢卟酚成分单一，在人源性结肠腺癌HCT116细胞株实验中比光敏素（含有卟啉成分的混合物）显得更有杀伤力[6]。高亲脂性的光敏剂3THPP和光敏素容易透过细胞膜定位在线粒体，PDT后凋亡启动快，较早就可以检测到DNA梯带，但没有典型的凋亡小体，而低亲脂性的TPPS2a和TPPS4只能通过内吞方式先进入溶酶体水解成单体，然后释放出来经光照才启动凋亡，速度缓慢，所以较晚检测到凋亡小体[7]。在人源性表皮样癌A431细胞株中，低剂量(7～28 mg/ml) 光敏素通过线粒体介导的内部途径来启动凋亡，高剂量（28 mg/ml）则直接使线粒体肿胀、裂解等[8]。光敏素与内皮细胞、3T3 ?Balb成纤维细胞株、人源表皮状癌A431细胞孵化时间较短时，PDT后主要引起细胞凋亡，孵化时间长就直接导致坏死[9]。由此可见，不同光敏剂的种类、理化性质、构成、剂量、跨膜方式、亚细胞定位、孵化时间等因素均可影响着细胞死亡进程、方式以及启动环节，而且，即使是同一光敏剂，由于条件不同，光照后也会在促进细胞死亡过程中产生差异，呈现一种复杂性、多样化特点。
2.3 光源
PDT技术应用的光源大致可分为普通光源和激光光源两类，普通光源由于自身存在许多缺陷而遭摒弃，目前应用最广泛的是激光光源。光能量密度和功率密度是光源两个重要的影响因素。Engbrecht以光敏素为光敏剂，在恒定的250 mW/cm2功率密度上，应用50～300 J/cm2不同的光能量密度作用于裸鼠肉瘤模型，在100 J/cm2能量密度时才达到多数裸鼠产生完全治疗反应而又不致死，进一步研究发现PDT后最早在4小时出现肿瘤闭塞血管壁上的内皮细胞首先凋亡，随后才广泛出现[10]。在相同的光功率密度时，低能量密度（2.5～3.5 J/cm2）可使人源性表皮样癌A431细胞产生凋亡和死亡两种方式，高能量密度（＞6 J/cm2）则大部分表现为死亡，以至于Henderson 认为光功率密度是PDT机制的“调节器”[11,12]。
2.4 凋亡调节相关基因
凋亡是细胞死亡的主动形式，目前认为，凋亡启动主要有两条途径：一条是激活肿瘤坏死因子(TNF)基因家族的细胞表面死亡受体，然后活化caspase 家族中的caspase?8前体开启凋亡程序，常称为外部通路；另外一条是通过破坏线粒体功能，释放细胞色素c，活化caspase?9而引发，常称为内部通路。两条通路受到许多相关基因的调节和参与。p53是调节细胞凋亡的重要基因，在PDT诱导凋亡机制中， Zhang等4个研究小组的实验结果表明[13～16]，在使用不尽相同光敏剂的情况下，野生型p53均表现出通过诱导凋亡来增强结肠癌细胞、HL60白血病细胞、人成纤维细胞对PDT的光敏化作用，突变型p53则不具有该种功能；Lim联合应用PDT和腺病毒p53重组体（AdCMVp53）对人源性宫颈癌CaSki细胞株和裸鼠模型进行研究，结果显示两者还具有协同抗肿瘤作用，认为p53至少是PDT凋亡诱导途径之一[17]。但也有研究小组却得出相反结果，认为p53没有影响或调节PDT凋亡过程[18,19]。由此可见，PDT凋亡存在依赖p53和非p53两大类途径，这种凋亡途径的不同可能与研究对象、光敏剂种类、光源等具体实验条件的不一致以及p53基因功能的复杂性等因素有关，需要更深入的研究。
bcl?2基因家族是细胞凋亡的另外一个重要调节者，根据功能分为两大类：促凋亡基因（如Bax、Bak等）和抗凋亡基因（如Bcl?2、Bcl?xL等），通过它们的表达产物即促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白影响凋亡能否启动。促凋亡基因Bax、Bak在PDT诱导凋亡机制中的作用研究比较多，看法基本一致。2001年，我国学者应用免疫组化方法比较鼻咽癌组织在PDT前后Bak表达情况，结果示PDT后Bak表达明显上调，随后Chiu用Bax反义寡核苷酸处理人源性乳腺癌MCF?7c3细胞株后，PDT诱导的凋亡减少了50％，而恢复人源性前列腺癌DU?145细胞株Bax功能，原先的PDT凋亡抵抗即消失[20]。在敲除Bax基因的人源性结肠癌HCT116细胞株和双敲除Bax/Bak基因的细胞株实验中，分别出现PDT凋亡抵抗和线粒体、内质网等遭受光损伤引发致命的自吞噬死亡[21,22]。所以，在Bax/Bak表达丰富或缺乏的组织细胞，PDT后引发细胞死亡的途径是不一样的，前者通过凋亡，后者则通过自吞噬行为。
抗凋亡基因的研究主要集中在Bcl?2、Bcl?xL。研究表明，Bcl?2蛋白具有PDT凋亡抵抗作用，但这种作用很有限。首先，在维替泊芬光增敏剂（50～100 ng /ml）作用下，过度表达的Bcl?2其抗凋亡作用很难阻挡线粒体遭受光损伤引发的细胞死亡进程[23]；其次，PDT可直接选择性裂解Bcl?2蛋白，提高Bax/ Bcl?2比例，联合应用诸如紫杉烷类等以Bcl?2为靶点的药物时，更能产生显著的凋亡诱导；最后，Bcl?2蛋白本身就是一些光敏剂的作用靶点[24]。因此，PDT过程对Bcl?2的作用是多层次的。与Bcl?2相比，Bcl?xL研究报道则较少。过度表达的Bcl?xL具有抑制caspase激活、DNA断裂因子降解等作用，但在以酞菁为光敏剂的实验中，发现Bcl?xL蛋白也是光损害作用的靶点，而且线粒体膜上的Bcl?xL蛋白更容易受损伤，提示Bcl?xL参与了PDT凋亡过程[25]。
2.5 一氧化氮
一氧化氮（NO）是一种气态自由基，它在细胞凋亡诱导中有着重要作用，但其影响是具体而复杂的。1998年，Gupta在人源性表皮样癌A431细胞株研究中，发现光照15s后即见原生型一氧化氮合酶快速表达，随后Dalbasti和Ali分别用电化学方法、荧光标记法直接证实PDT过程的NO产生和分布，提示NO参与PDT凋亡诱导过程，但其所发挥的作用有不同看法[26,27]。Gomes认为NO通过cGMP机制可以减少光照后细胞死亡，Niziolek则认为NO通过抑制其它含氧自由基介导的脂质过氧化作用来保护细胞膜免遭PDT损害，这种PDT抵抗在以后的研究中再次得到证实[28～30]。但是Lu和Yamamoto研究结果与上述刚好相反，认为NO分别通过增加细胞色素C释放、上调p53和p21表达以及增加原卟啉Ⅸ累积、减弱线粒体含铁酶活性等机制，最终起到促进PDT凋亡的作用[31,32]。甚至有人认为NO介导的细胞毒性与PDT损害是独立的，两者无交叉关联[33]。
2.6 靶细胞类型
He用光敏素II研究3种癌细胞株对PDT凋亡的反应，在50％致死率（LD50）的剂量下，只有鼠源性乳腺癌MTF7细胞株产生快速调亡，人源性前列腺癌PC3细胞株在LD85的剂量时才有明显反应，人源性非小细胞肺癌H322a细胞株没有产生凋亡而表现为坏死[34]。Wyld以氨基酮戊酸（ALA）为光敏剂，扩展为5种细胞株即人源性乳腺癌MCF?7和T47D、人源性前列腺癌HT1197、人微血管内皮细胞（MVECs）及大鼠Walker癌（WRC），结果HT1197和WRC在LD50主要表现调亡，LD90则表现为坏死，MCF?7和T47D在LD50、LD90均为表现坏死，MVECs表现为缓慢调亡，而且它们出现PDT明显反应的时间和高峰期都不全相同[35]。以上研究结果说明，由于靶细胞类型不同，在各自相同的条件下，可以产生不同的细胞死亡方式和死亡时间。
2.7 细胞因子
PDT可直接使靶组织产生急性炎症反应，从而引发促炎因子释放，而其破坏组织血供又招致生长因子的参与，因此，涉及PDT的细胞因子主要是促炎因子和生长因子两大类。前者包括白细胞介素（IL）类、肿瘤坏死因子?а（TNF?а）、白细胞三烯、组胺等，后者有血管内皮生长因子（VEGF）。由于促炎因子种类繁多，所以它们对PDT细胞死亡机制的影响表现多样，其中IL?6是研究比较多的促炎因子。PDT可使IL?6表达水平增高，但受到细胞类型、组织分化程度、基础表达水平的影响[36]。Usuda把IL?2、IL?6和TNF?а基因分别转染到Lewis肺癌（LLC)细胞上，形成LLC?IL?2、LLC?IL?6、LLC?TNF?а三个细胞株，实验显示LLC?IL?6细胞株比另外两个细胞株易遭受光损害导致细胞凋亡，提示IL?6可调节细胞对PDT的光敏性，但IL?6表达过渡亦会反过来通过增加Cox?2和VEGF水平抗凋亡[37,38]。PDT亦可使VEGF表达增加，应用Avastin抑制VEGF表达就能够增强PDT的治疗效应。面对自己诱发产生的不利的细胞因子，研究发现PDT具有调控靶细胞对它们不产生应答的能力来规避影响[39]。
3 光动力学疗法在结直肠肛门外科中的临床应用
光动力学疗法在结直肠肛门外科中临床应用大约10年余，由于它是一种局部疗法，结直肠癌又以手术切除为主，因此，其应用范围相对比较局限。根据报道，其具体适应症主要集中在以下几个方面[40～47]：①不愿或无法手术切除的进展期结直肠癌，通过内镜PDT进行姑息治疗或改善梗阻、出血等症状；②手术切除结直肠肿瘤主要病灶，其它残余小病灶行PDT治疗；③结直肠癌肝转移灶；④结直肠腺瘤，尤其是基底宽或呈片状的绒毛状腺瘤；⑤原位肛管癌或高级别上皮内瘤；⑥直肠癌复发的术中辅助治疗。
目前，PDT在结直肠肛门外科中的临床应用大多数都是个案或小宗病例报道，但在鲜红斑痣等某些疾病已经有大宗病例应用的报道，从应用的情况来看，PDT是一种安全有效、并发症少的治疗方法。结直肠癌是结直肠肛门外科的主要病种，其5年生存率一直徘徊在50%～60%左右，单靠手术治疗难以取得更大的突破，因此必须寻找手术以外的其它手段来配合或补充治疗以期获得更好的疗效，PDT就是其中一个不错的治疗手段。随着疗效佳的光敏剂的研发和激光发生器的改进以及腹腔镜外科等技术的，我们认为在结直肠肛门外科中，除了扩大上述应用病例数以总结更多的治疗经验外，尚可充分利用其优势，尝试在以下几个方面拓展应用：①晚期直肠癌浸润骶前、术中残留病灶的辅助治疗②进展期结直肠癌腹腔镜下切除的术中辅助治疗③高龄或有其它严重合并症不能耐受麻醉的早期、进展期结直肠癌的治疗④肛门周围一些良性病变的治疗。
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