β?catenin、c?myc在结直肠肿瘤中的表达及其意义

                作者：张丽娟 李梅 陈云 杨承纲

【摘要】  目的：探讨β?catenin、c?myc的表达在结直肠肿瘤发生中的作用及其与临床病理参数之间的关系。 方法：应用免疫组织化学SP法检测β?catenin及c?myc在结直肠正常黏膜、结直肠腺瘤和结直肠腺癌中的表达。结果：（1）β?catenin在正常黏膜中为胞膜表达，腺瘤与腺癌组呈胞浆或核异位表达，异位表达率为10.8%、75.0%、98.2%，3组之间有显著差异（P<0.01）。（2）正常黏膜、结直肠腺瘤和结直肠腺癌中c?myc的表达率为10.8%、40.6%、70.2%。3组之间有显著差异（P<0.01）。（3）结直肠腺癌中β?catenin的异常表达随着肿瘤大小、组织学分级、Dukes分期的改变呈逐渐增高趋势，有淋巴结转移者β?catenin阳性表达率(100.0%)高于无淋巴结转移者(96.4%)，但无统计学意义（P>0.05）。结论：β?catenin的异常表达及c?myc的过表达与结直肠肿瘤的发生发展有关，β?catenin的异常表达可能与结直肠腺癌的恶性行为有关。

【关键词】  结直肠肿瘤 β?catenin c?myc 免疫组化

    Expression of β?catenin and c?myc in human colorectal adenocarcinoma

    Abstract  Objective: To investigate the expression of β?catenin and c?myc in colorectal carcinomas and their relation to clinical pathological parameters. Methods: The expression of β?catenin and c?myc protein was detemined with immunohistochemical SP method in the normal mucosas, the adenomas and the adenocarcinomas. Results: (1) β?catenin expression was detected on the cell membrane in normal colorectal mucosa. Cytoplasmic and nuclear expression was detected in the colorectal adenomas and adenocarcinomas. The aberrant expression rates of β?catenin were 10.8%, 75.0% and 98.2%.There were significant difference among these three groups（P<0.01）.(2) c?myc was expressed in 10.8% of the normal mucosas, 40.6% of the adenomas and 70.2% of the adenocarcinomas. There were significant difference among these three groups（P<0.01）.(3) In carcinoma of intestine the bigger the tumors size and the higher grade were, the higher the aberrant expression of β?catenin was. Tumors with regional nodal metastasis showed higher abnormal staining rate (100.0%) than those without nodal involvement (96.4%). But there was no significant difference（P>0.05）. Conclusion: The aberrant expression of β?catenin and the overexpression of c?myc may be related with the carcinogenesis development of colorectal carcinoma. The aberrant expression of β?catenin may play a role in the  development of colorectal carcinoma.

    Key words  Colorectal neoplasm; β?catenin；c?myc；Immunohistochemistry

    结直肠肿瘤的发生是一个多基因多步骤的改变过程，目前倍受关注的APC?β?catenin?Tcf?4通路在结直肠癌的发生中起着重要的作用，其致癌的关键是β?catenin 降解障碍致使细胞浆内游离的β?catenin积聚，并进入到细胞核与转录因子TCF/LEF结合，激活下游靶基因c?myc等的转录，引起细胞增殖和分化失控，导致肿瘤的发生[1]。本研究应用免疫组化法检测β?catenin及c?myc在结直肠正常黏膜、结直肠腺瘤及结直肠腺癌中的表达，探讨它们的表达与结直肠肿瘤发生发展的关系。

    1  材料和方法

    1.1  研究对象:选取本院病理科2001年1月至2005年10月期间结直肠腺癌根治性切除并经病理检查确诊的57例结直肠腺癌标本及同期手术切除和纤维结肠镜活检的32例结直肠腺瘤组织标本。其中以每例结直肠癌标本的远端切缘黏膜，并经病检查证实未见癌组织浸润者界定为正常黏膜，共有37例。按全国结直肠癌病理研究规范分类Dukes分期[2]，A期8例，B期20例，C期28例,D期1例。其中高分化腺癌14例，中分化腺癌28例，低分化腺癌15例。本组无其他类型结直肠肿瘤。结直肠腺瘤标本中，管状腺瘤11例，绒毛状管状腺瘤11例，绒毛状腺瘤10例，所选择的腺瘤均不伴有腺上皮重度不典型增生。全部病例均无家族性息肉病史或慢性溃疡性结肠炎病史，术前均未行放化疗。所有标本均采用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚度4 μm。

    1.2  检测方法：应用链霉菌素?生物素（SP）免疫组化技术分别检测组织中β?catenin及c?myc的表达，按试剂盒说明书操作进行，用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照，操作步骤按试剂盒说明书进行。β?catenin及c?myc试剂、SP试剂盒均为福州Maxin生物技术公司产品。

    1.3  结果判定：β?catenin染色标准按照Maruyama等[3]方法。从细胞膜、细胞浆和细胞核3个方面判断β?catenin的表达特征，正常β?catenin表达主要定位于细胞膜，当>70%细胞膜阳性表达者为正常表达，反之为细胞膜表达缺失；当>10%细胞浆和细胞核阳性表达者为异位表达，细胞膜表达缺失和异位表达统称为异常表达。c?myc阳性肿瘤细胞的胞浆和（或）胞核染成棕黄色，阳性细胞数<10%为阴性表达（?），阳性细胞数≥10%为阳性表达（+）。

    1.4  统计学处理：采用SPSS10.0统计软件进行χ2检验，结果以P＜0.05作为差异有显著意义的检验标准。小样本采用Fisher精确概率法比较其差异的显著性，当P＜0.05时，认为差异有显著性。

    2  结  果

    2.1  β?catenin在不同结直肠组织中的表达：正常结直肠黏膜β?catenin表达呈清晰的棕黄色染色，阳性细胞几乎全部定位于细胞膜上，仅有个别标本细胞浆有极弱染色，未见细胞核有表达。结直肠腺瘤组织的β?catenin细胞浆的异位表达增加,细胞膜表达不同程度的减弱。结直肠腺癌组织中β?catenin细胞浆和细胞核异位表达率增加，显著高于结直肠腺瘤，差异有显著性意义(见表1)。在不同组织学类型的结直肠腺瘤中，管状腺瘤β?catenin异位表达率与绒毛状管状腺瘤、绒毛状腺瘤比较有统计学意义(见表2)。 表1  正常结直肠黏膜和结直肠肿瘤组织中β?catenin的表达注：*为结直肠腺瘤与正常黏膜相比，**为结直肠腺瘤与结直肠腺癌相比，***为结直肠腺癌与正常黏膜相比表2  结直肠腺瘤组织类型与β?catenin表达的关系注：*管与绒管，**绒管与绒，***绒与管

    2.2  c?myc在不同结直肠组织中的表达：c?myc阳性表达产物主要位于细胞质和细胞膜上，正常结直肠黏膜中可见在腺体陷窝增生区有部分表达，腺瘤中以细胞浆着色为主,而在腺癌中则细胞核、细胞浆均着色，以细胞核着色为主。本实验结果显示结直肠腺瘤与结直肠腺癌组织中c?myc蛋白阳性表达率明显高于正常结直肠黏膜(见表3)。绒毛状腺瘤c?myc蛋白阳性率高于管状腺瘤和绒毛状管状腺瘤，但差异无显著性意义(见表4)。表3  正常结直肠黏膜和结直肠肿瘤组织中c?myc的表达表4  结直肠腺瘤组织类型与表达c?myc的关系（注：同表2注

    2.3  β?catenin、c?myc蛋白表达与结直肠腺癌临床病理参数的关系：见表5。

    经统计学处理结直肠腺癌组织中c?myc的表达与肿瘤大小、大体类型、分化程度、Dukes分期以及淋巴结转移情况无关（P>0.05）。从表5中可以看出β?catenin蛋白的异常表达随着肿瘤大小、组织学分级、Dukes分期的改变呈逐渐增高趋势，且有淋巴结转移者β?catenin蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移者，但无统计学意义（P>0.05）。表5  β?catenin、c?myc与结直肠癌临床病理参数之间的关系

    3  讨  论

    Wnt信号传导通路调控着细胞的生长、运动和分化，已确认是与肿瘤相关的一个关键性信号通路[4]，β?catenin是Wnt信号通路的成员之一。Wnt通路活化后可影响基因表达而促进细胞增殖，在胚胎发育过程中是必须的，但在成熟细胞中则会导致肿瘤的发生和生长，正常成熟细胞没有Wnt信号，胞浆内的β?catenin大部分与细胞膜上的E? 钙黏蛋白结合，参与细胞同质性粘附，少部分与细胞浆内的APC、轴蛋白（Axin）、糖原合成酶激酶3β （GSK?3β,glycogen synthase kinase?3β）结合形成降解复合体，最终被蛋白酶体降解，因而胞浆内游离的β?catenin水平极低，不能进入细胞核调控相应基因的表达。而肿瘤细胞中由于β?catenin基因的突变形成异常Wnt通路，使β?catenin不能磷酸化被降解，导致β?catenin在细胞浆内累积，并转移到细胞核与转录因子Tcf/LEF结合，激活相关靶基因如c?myc、CyclinD1等的转录[5]，因此细胞浆内游离的β?catenin蛋白水平升高并进入细胞核是致癌的关键。

    β?catenin基因定位于人染色体3P21上，全长为23.2 kb，它是一种原癌基因，已有报道β?catenin与多种肿瘤的发生、关系密切[ 5,6]。它编码的蛋白质相对分子量92 ki，在正常的结直肠黏膜上皮细胞的表达主要定位于细胞膜上。β?catenin既可被自身的稳定突变直接激活，也可因丧失其调节基因的APC的抑制而被激活，APC基因的突变可改变APC蛋白与β?catenin及E钙黏附蛋白之间的平衡，导致细胞?细胞、细胞?基质之间黏附作用以及接触抑制信号传递的改变，引起细胞分裂与细胞死亡之间的平衡失调，以至生长失控，成为结直肠癌的一个限速的分子因素[7]。本研究中结直肠正常黏膜β?catenin细胞膜表达，腺瘤为细胞浆表达为主，腺癌以胞浆或核表达为主。β?catenin在正常黏膜、腺瘤和腺癌中均有异位表达，其异位表达的阳性率分别为10.8%、75%、98.2%，两两之间均有统计学差异（P<0.01），而且在本研究中我们还发现，在腺瘤中β?catenin的异位表达以细胞浆表达为主，并随着腺瘤的不同组织学类型有所变化，在绒毛状腺瘤中可见偶有胞浆或核的异位表达，而在腺癌中几乎均为胞浆或核的异位表达，这也应证了β?catenin首先在细胞浆内累积，后转移到细胞核与转录因子Tcf/LEF结合，激活相关靶基因的理论，也进一步说明在“正常上皮—腺瘤—侵袭性癌”的演变过程中β?catenin的异位表达起着重要的作用，且是早期事件。 这一结论与黄凯等[8]的结论一致。癌的发生与腺瘤的类型有关：浸润癌发生于管状、管状绒毛状和绒毛状腺瘤的比例各约2%～3%、6%～8%和10%～18%，本研究中β?catenin在腺瘤中的异位表达率分别为36.4%、90.9%和100.0%，管状腺瘤与绒毛状管状腺瘤、绒毛状腺瘤之间有统计学意义（P<0.05），提示β?catenin的异常表达可能与腺瘤的恶性转化易感性有关。β?catenin异位表达与肿瘤侵袭、转移及预后的关系尚有不同意见。李刚等[9]研究发现β?catenin异位表达、膜表达缺失与结直肠癌侵袭、转移密切相关；而戴文斌等[10]的研究认为β?catenin异位表达与结直肠癌分化、侵袭、转移及Dukes分期无关。本研究中β?catenin蛋白的异常表达随着肿瘤大小、组织学分级、Dukes分期的改变呈逐渐增高趋势，且有淋巴结转移者β?catenin蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移者，但无统计学意义（P>0.05），这提示β?catenin可能与结直肠肿瘤的恶性行为有关。β?catenin异位表达与肿瘤侵袭、转移及预后的关系还有待于进一步的研究。

    c?myc是原癌基因myc家族中的一员，位于人8号染色体长臂上（8q24），具有诱导肿瘤增殖和凋亡的作用。1998年Tong Chuan He等[11]证实了c?myc是WNT途径的靶基因，他们在结肠癌细胞中发现：因APC突变而形成的β?catenin?Tcf?4 复合体通过与c?myc基因启动子上Tcf?4的结合位点作用，使之活化表达，这就解释了为什么c?myc在结肠癌许多阶段都处以过表达状态。β?catenin在核的聚积导致了c?myc癌基因的转录、表达，从而与结直肠癌的发生发展密切相关[12]。本研究中正常结直肠黏膜中可见在腺体陷窝增生区有部分细胞核有阳性表达，这可能是因为c?myc属于正常细胞结构基因的一部分，与细胞生长分裂密切相关。另外在本研究中发现癌前组织中c?myc表达主要定位于细胞质中，癌变后部分定位于细胞核，部分定位于细胞质，提示c?myc可能在细胞癌变前后作用方式与功能有所不同。本研究结果显示在结直肠癌组织中c?myc阳性率为70.2%，结直肠腺瘤中阳性率40.6%，正常结直肠黏膜中阳性率为10.8%，两两之间均具有统计学意义（P<0.01）。c?myc在癌前病变组织中有过度表达，且正常结直肠黏膜、腺瘤、癌组织其表达逐渐升高，提示c?myc表达在肿瘤的发展中可能是一个早期变化，是细胞的增殖及恶性转化的重要标记，从结直肠正常黏膜组织到结直肠癌的恶性转化过程中，c?myc的表达上发挥了重要的作用，这与临床上结直肠癌经历由“正常上皮—腺瘤—侵袭性癌”的演变过程的事实相符。在不同组织学类型的结直肠腺瘤中c?myc的阳性表达无统计学差别，提示c?myc可能只在腺瘤癌变的过程中发挥作用，但绒毛状腺瘤c?myc的阳性表达率明显高于管状腺瘤和绒毛状管状腺瘤，提示c?myc的阳性表达可能与腺瘤的恶性转化易感性有关，这将有待于进一步的研究。在本研究发现c?myc的表达与肿瘤大小、大体类型、分化程度、Dukes分期以及淋巴结转移情况无关（P>0.05），说明在结直肠癌的恶性演进过程中c?myc可能不起作用。国内学者姜涛等[13]经过试验也预见在结直肠腺癌中c?myc表达程度与肿瘤细胞的生物学特性是不相关的，它不能作为判断患者预后的单独指标，与本研究的结论相似。

    结直肠癌分子模型认为结直肠癌的发生是由正常黏膜形成腺瘤，然后癌变，转变成浸润性癌，再发生转移的渐进过程，而Wnt通路的异常激活与结直肠癌的发生密切相关，所以对Wnt通路的成员β?catenin，及其靶基因c?myc的研究在结直肠肿瘤的诊断和上有着巨大的潜力。

【文献】
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3Maruyama K,Ochiai A,Akimoto S,et al.Cytoplas mic beta?catenin accumulation as a predictor of hematogenous metastasis in human colorectal cancer.Oncology,2000,59(4):302?309.

4Behrens J,Lustig B.Tho Wnt connection to tumorigenesis .Int J Dev Biol,2004,48(5?6):477?487.

5Cowin P,Rowlands TM,Hatsell SJ.Cadherins and catenins in breast cancer.Curr Opin Cell Biol,2005,17:499?508.

6Mazieres J,He B,You L,et al.Wnt signaling in lung cancer.Cancer Lett,2005,222:1?10.

7马宗源，李祺福.APC蛋白的结构特征及其与细胞骨架的关系.生命，2004,16（1）：16?18.

8黄 凯，许东坡，叶建新.散发性结直肠腺癌APC、β?catenin基因的表达及其意义.实用癌症杂志，2006，21（2）：134?136.

9李 刚，王万里，魏 莉.E?cadherin、 β?catenin、FAK在大肠癌的表达及其意义.肿瘤防治研究，2005，32（9）：52?54.

10戴文斌，任占平，陈蔚麟，等.大肠癌APC、β?catenin、E?cadherin和c?myc的表达及意义.山东医药，2007，47（6）：4?6.

11Tong Chuan He ，Andrew B Sparks,Carlo Rago,et al.Identification of c?myc as target of the APC pathway.Science,1998,281(5382):1509?1512.

12Rachel H,Johan H,Van ES,et al.Caught up in a wnt storm:wntsignalingincancer.Biochimica BiophysicaActa,2003,1653:1?24.

13姜 涛，田晓丰，张 广，等.癌基因c?myc在大肠腺癌中的表达及临床意义的研究.实验诊断学，2004，8（6）：615?616.