早期结直肠癌基因诊断的研究进展
【关键词】 直肠癌 基因诊断
结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,我国1990～1992年27个省,自治区,直辖市恶性肿瘤死亡抽样调查(约占同期人口10%)结果发现,结直肠癌发病率以4%的年增长率迅速升高,目前占消化道肿瘤的第二位[1]。所谓早期结直肠癌一般指Dukes A期癌，系指癌肿浸润深度达黏膜下层和固有肌层。由于结直肠黏膜内无淋巴管存在，所以早期结直肠癌一般不会发生淋巴结转移，可以治愈，若能发现Duckes A期则可以提高生存率。待患者出现症状时才来就诊，已非早期，故结直肠癌的早期诊断就显得尤为重要。
许多研究表明，结直肠癌变是一个涉及原癌基因激活、抑癌基因失活等多基因、多阶段、多步骤渐进演化的积累过程。与结直肠癌相关的抑癌基因有p53、APC、DCC等，原癌基因有K?ras、c?myc等。因此测定与结直肠癌发生密切相关的基因有助于早期结直肠癌的诊断。
1 CD44
人的CD44基因位于第11号染色体短臂上,大小约60kb,含有20个外显子。其中外显子6～15(即V1～V10) 在转录过程中易于通过选择性剪接形成剪接变异体,即CD44V。Coppola D等[2]对34例结直肠癌切除标本的检测结果发现:腺瘤中CD44V6检出率为100%,癌为91%,转移灶最弱,仅38%,因此认为D44V6的表达是结直肠癌的早期标志。国内吴健雄[3]等的研究证实: CD44V mRNA 在结直肠癌中的异常表达具有普遍性,既可能是早期癌变伴随出现的生物学标志,也可能是判断结直肠癌转移的有用指标。Kim等[4]认为,在结肠癌进展过程中,CD44基因的表达与突变的K?ras基因相关联，是被活化的H?ras基因所诱导,并认为此种异常表达早于K?ras和p53基因突变。因而认为,CD44V6基因异常表达是肿瘤发生的早期事件。Yamao[5]等应用RT?PCR及Southern杂交技术检测了25例结直肠癌患者及15例健康对照者粪便中脱落细胞的CD44、CD44V6及CD44V10的表达。结果显示结直肠癌患者的CD44V6及CD44V10的阳性检出率分别为68％和60％，术后的阴转率分别为88.2％和80.0％。而且CD44V6及CD44V10均可在Duckes A期患者术前粪便中检出。因而,对粪便中脱落细胞的CD44基因异常表达分析可作为非侵袭性方法用于结直肠癌患者的早期诊断及无症状高危人群的筛选。
2 p53
p53基因位于人类17号染色体短臂( 17p13.1)。全长约1620kb。由11个外显子和10个内含子组成。p53基因在进化过程中高度保守,外显子2、4、5、7、8分别编码5个在进化上高度保守的结构。野生型p53(WT?p53)与调控细胞生长周期、调节细胞转化、DNA复制、诱导细胞程序性死亡有关。有实验表明,分化良好的腺瘤,包括家族性多发性结肠息肉这一常染色体显性遗传病以及结直肠息肉中p53的表达明显低于结直肠癌[6]。结直肠癌p53基因的缺失率为50％～70％[7～9]1996年，Eguchis等采用PCR?SSCP技术对11例结直肠癌患者的粪便进行检查，7例中查到p53基因突变(64％)。综上，p53基因的缺失或突变与结直肠癌的发生密切相关。
3 DCC
结直肠癌缺失基因(Deleted in Colorectal Carcinoma ,DCC) 作为90年代发现的肿瘤抑制基因,其与结直肠癌的相关性研究正在不断深入。Vogelstein[10]等报道,在结直肠黏膜上皮由正常转化为上皮增生和腺瘤,并演进到癌变的过程中,有47%的进展期腺瘤(腺体或细胞呈中、重度不典型增生)和73%的结直肠癌细胞中可检出染色体18q有LOH（DCC等位基因的杂合性丢失 Loss Of Heterozygosity,LOH）,但在早中期腺瘤(<1.0 cm)很少见。而在90%的有18qLOH的病人中,缺失区包含了DCC基因位点[11,12]。Goi[13]等用Western blotting法检测结肠癌、癌旁组织及腺瘤中的DCC蛋白表达情况,则发现癌组织中DCC蛋白明显减少或缺失,在腺瘤组织中DCC蛋白有明显表达,与正常组织几乎相同,提示DCC基因缺失或失活是结肠腺瘤向癌转变的一个促发因素。DCC基因是目前发现的最长的人肿瘤抑制基因,尤其在结直肠癌的发生中具有重要意义,其失活和表达异常与结直肠癌的诊断关系密切。但DCC基因的失活机制、DCC蛋白的功能及其诱导细胞分化的机制还有待于进一步探索。
4 Ras
Ras基因家族分为K?ras、H?ras、N?ras,基因编码蛋白质的相对分子质量均为21 Ku，故称为p21。Ras 基因的突变在结直肠细胞癌变过程中起启动作用并是一个早期事件,突变产生具有致癌活性的p21蛋白,通过Ras信号转导通路,激活下游信号分子,持续刺激细胞生长、发育、增殖,引起细胞恶变。Smith?Ravin等[14]研究证实结直肠癌患者粪便中K?ras基因突变率达40％～50％以上，且突变点多位于12密码子，这就为结直肠癌点突变的诊断提供了方便。
5 APC
APC基因是结直肠癌常见的变化基因之一，和结直肠癌的关系密切[15～18]，发生于结直肠癌的早期。APC基因与ras基因一起被认为是结直肠癌发生的促发事件[19]。激活型ras基因能使缺乏APC基因的正常小鼠上皮细胞转化肿瘤细胞[20]。而且Friedl等报道APC基因突变位点与病变程度有关[21]。Powell等[22]通过对APC基因编码区及剪切位点的测序发现，63％的结直肠腺瘤、60％的结直肠腺癌有APC基因的突变。由于APC基因是结直肠癌发生的早期事件，随着分子生物学的进步，可望成为早期结直肠癌的诊断焦点。
6 bcl?2
凋亡或程序性死亡(PCD)在组织的发生、分化和内稳态的调节中起重要的作用，而bcl?2与凋亡的关系较为密切，通过抑制细胞凋亡而调节细胞运动。bcl?2作为一种原癌基因，可以通过PCD而有利于肿瘤细胞的生长，在癌组织中bcl?2基因重排在结直肠癌早期就已出现。骆成玉[23]等应用半巢式PCR检测发现，28例结直肠癌组织标本中24例（85.7％）捡出重排；粪便中检测出17例bcl?2重排（70.8％）。由此可见，检测粪便中脱落癌细胞的基因有助于早期结直肠癌的诊断。
结直肠癌是一种严重危害人类健康的常见恶性肿瘤,近年来随着国民的发展,生活水平的提高,生活方式及生活环境的变化,结直肠癌的发生率有逐年上升的趋势。结直肠癌相关基因、基因突变体及其表达产物对早期诊断具有可行性和实用性，尤其是PCR技术的应用大大提高了检测的敏感性，可以说为结直肠癌的早期诊断开辟了分子途径。但是还存在着方法复杂、费用昂贵、难以推广等问题，这将有待于降低诊断试剂和仪器的成本，改进和普及实验方法来解决。随着分子生物学的迅速发展，基因诊断将成为早期结直肠癌诊断的重要手段。
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23骆成玉，李世拥，祝学光.应用半巢式PCR检测大肠癌组织及患者粪便中bcl?2基因的重排.中华实验外科杂志，1999，16（3）：197.
