大黄素对脓毒症大鼠保护作用的实验研究
【摘要】 目的 探讨大黄素对于脓毒症大鼠的保护作用。 方法 将健康大鼠随机分为三组，A组：假手术组；B组：盲肠结扎穿刺（CLP）组；C组：CLP大黄素组。造模72h后分别测定各组血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血浆和腹腔白蛋白浓度、肠系膜微静脉流速等并观察肠粘膜损伤程度。 结果 CLP后大鼠血浆TNF-α浓度、白蛋白渗出率明显升高，而B组升高较C组明显（P<0.01），肠粘膜损伤评分变化也有相同趋势（P<0.017）；肠系膜微静脉流速减慢，血浆白蛋白浓度降低，而B组下降较C组明显（P<0.05）。 结论 大黄素能减轻CLP所致脓毒症大鼠的炎症反应和肠粘膜的损伤。
【关键词】 大黄素 脓毒症 肿瘤坏死因子-α 大鼠
【Abstract】Objective To investigate the protective effect of trioxymethylanthraquinone to rat sepsis. Methods Healthy rats were divided into 3 groups, group A as control group; group B as caecal ligation plus puncture （CLP）group and group C as trioxymethylanthraquinone group. Plasma concentrations of TNF-α, mesenterium microcirculation flow rate, plasma and peritoneal concentrations of albumin were measured, pathological changes in intestinal mucosa were observed 72h after operation. Results TNF-α and ratio of plasma albumin versus peritoneal albumin were notably increased after CLP, and it was lower in group C than in group B（P<0.01）. Less damage in intestinal mucosa was observed in group C than in group B（P<0.017）. Mesenterium microcirculation flow rate and plasma albumin were decreased after CLP, and they were higher in group C than in group B（P<0.05）. Conclusions trioxymethylanthraquinone could reduce the inflammatory response and extenuate the damage to intestinal mucosa in rat sepsis.
【Key words】trioxymethylanthraquinone tumor necrosis factor-α rat
脓毒症是由感染因素引发的全身炎症反应综合征（SIRS）。全球每年发病高达1800000例次，严重的脓毒症死亡率接近30%［１］。其临床特征为继发于各种严重感染的全身高代谢状态、高动力循环状态与过度的炎症反应［2］。本实验采用盲肠结扎穿刺（CLP）法建立脓毒症大鼠模型，测定比较大鼠血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、腹腔白蛋白渗出率、肠系膜微静脉流速和肠粘膜损伤病理评分等指标，观察大黄素对脓毒症大鼠的保护作用，并探讨其作用机理。
1 材料与方法
1.1 模型制备
健康、雄性的Sprague-Dawley(S-D)大鼠30只，体重180-230g（浙江中医药大学实验动物中心提供），随机分为3组，分别为A组（假手术组)、B组（CLP组)和C组（CLP大黄素治疗组)，每组10只。腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液45mg/kg麻醉后，下腹正中切口2cm，暴露盲肠。A组翻动盲肠后关腹；B、C两组用丝线结扎三分之一盲肠，避免肠梗阻，18号针头穿刺并挤出少量肠内容物造成腹腔感染，盲肠回纳后关腹。C组造模后以大黄素（购自药品生物制品检定所）60mg/kg混悬液灌胃给药，2次/d，B组以等量生理盐水代替。实验中观察各组大鼠的精神状态、活动、进食等情况。
1.2 标本处理与检验方法
造模后72h，3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，开腹观察腹腔感染情况。以生理盐水6ml冲洗腹腔，收集冲洗液，3000rpm/min离心15min，取上清液。大鼠颈内静脉注射FITC荧光染色红细胞1ml，选择小肠系膜管径20-30nm的微静脉，利用BX50生物荧光显微镜（购自日本Olympus Optical 公司）、MedLab生物信号采集处理系统（购自南京美易科技有限公司）采录、分析微静脉流速。取下腔静脉血后处死动物，取空肠段约1 cm。血液静置30min后以3000rpm/min离心10min，取血浆，-70℃保存。空肠组织以10%甲醛固定液固定。血浆及腹腔渗出液白蛋白测定采用溴甲酚紫法（BCP）自动分析测定，血浆TNF-α测定采用放射免疫分析法（试剂盒购自解放军总科技开发中心放免所）。病理组织学检查取固定后的空肠标本，石蜡包埋切片，HE染色后用普通光学显微镜观察，并进行肠粘膜损伤病理评分［3］。0级：正常粘膜绒毛；1级：上皮下间隙扩大，血管充血；2级：上皮下间隙扩大明显，上皮与固有层分离；3级：粘膜上皮剥脱，部分绒毛尖端剥落；4级：绒毛剥落，固有层及扩张血管显露；5级：固有层分解，出血、溃疡。
1.3 统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件包，数值变量用（x±s）表示，采用Student-Newman-Keuls检验，分类变量采用Kruskal Wallis检验。
2 结果
2.1 一般情况
实验过程中30只大鼠均存活。A组大鼠精神状态好，活动正常，食欲佳。B、C两组大鼠手术后大多出现精神萎靡、活动减少和食欲减退的情况，有逐渐加重趋势。处死动物后，A组见腹腔内正常或有少量粘连。B、C两组见腹腔有血性或脓性渗出液，带恶臭，肠管胀气，内脏充血水肿失去原有光泽，两组间腹腔感染情况无明显差别。
2.2 三组间TNF-α、肠系膜微静脉流速、腹腔白蛋白、血浆白蛋白及白蛋白渗出率比较
CLP后大鼠血浆TNF-α浓度及白蛋白渗出率明显升高，B组升高幅度明显大于C组（P<0.01）；CLP后大鼠肠系膜微静脉流速减慢，血浆白蛋白浓度降低，B组下降幅度明显大于C组（P<0.05），见表1。表1 三组间TNF-α、肠系膜微静脉流速、腹腔白蛋白、血浆白蛋白及白蛋白渗出率比较（略）注：与A组比较，*P<0.05；**P<0.01，与B组比较#P<0.05；##P<0.01
2.3 病观察
A组肠粘膜正常或轻度水肿、充血（0-1级）, B组小肠绒毛剥落，固有层及扩张血管显露（4级），C组肠粘膜上皮与固有层分离部分上皮剥脱（3级），三组差异有显著性（P＜0.01）且B组与C组间有显著性差异（P＜0.017）。
3 讨论
大黄属蓼科草本植物，具有泻下攻积，清热解毒，凉血行瘀之功效。其主要成分有蒽醌类，大黄多糖，大黄鞣质等。大黄被认为在SIRS及多器官功能不全综合征（MODS）等方面有明显效果［４］。大黄素属于大黄蒽醌类，作为中药大黄的主要成分，其抗炎作用也受到重视。在对与SIRS关系密切的急性胰腺炎的研究中［５］大黄素被认为可以明显抑制细胞因子的释放并减轻急性重症胰腺炎的炎症反应。但大黄素对腹腔感染及其所致脓毒症的影响仍未阐明。
在对脓毒症的研究中，人们通常采用注射致死量大肠杆菌、注射内毒素脂多糖（LPS）及CLP等方法建立脓毒症的动物模型。其中CLP法被认为能更好地反映临床病理过程［6］。在本研究中，CLP后大鼠逐渐出现萎靡、躁动、竖毛、腹泻等表现；处死动物后剖腹见腹腔有血性或脓性渗出液，带恶臭，肠管胀气，内脏充血水肿失去原有光泽；术后大鼠血液炎性细胞因子如TNF-α较术前明显升高，与结果相符［7］，表明动物模型的复制是成功的。
白蛋白是肝细胞合成的分子量为650000的蛋白质，其主要生理功能是维持血浆胶体渗透压和转运血中各种物质。严重感染及其所引发的脓毒症常伴有低蛋白血症,并与预后密切相关［8］。目前认为，导致白蛋白水平的急剧下降的一个重要机制是血管通透性增加，白蛋白从血液移向血管外的其他组织。CLP后，当腹膜受到细菌感染而发生炎症时，腹膜充血、水肿，毛细血管壁通透性增加，大量白蛋白通过通透性增加的毛细血管，直接到达损伤组织，参与代谢，而此时白蛋白进入损伤组织往往是单向的［9］。用腹腔渗液白蛋白与血浆白蛋白的比值来衡量白蛋白经腹膜转运情况，是用于推测白蛋白经腹膜丢失的一个常用方法。本实验研究表明，CLP后白蛋白大量进入腹腔，同时血浆白蛋白的浓度下降；而大黄素对于白蛋白的这种丢失现象有一定的限制作用。
肠道在脓毒症和MODS病理过程中的作用日益受到重视。正常情况下，肠道粘膜对肠道内细菌和毒素有强大的屏障作用，但在肠粘膜屏障受损时，肠粘膜血管通透性增加，粘膜上皮水肿，上皮细胞及细胞间连接断裂，细胞坏死或凋亡形成溃疡，导致肠粘膜通透性增加，引起肠道细菌移位及肠源性感染即“二次打击”，而后者是MODS的主要原因。造成肠粘膜屏障损伤的机理复杂，主要有:1) 肠粘膜微循环障碍，酸性代谢产物积聚。肠粘膜PH值下降与肠粘膜通透性增加相一致［10］。酸性代谢产物的积聚导致局部酸中毒，可直接引起细胞代谢障碍、组织损伤，也可通过细胞外钙离子的内流增加而使细胞及组织水肿加重，上皮通透性增加。2)细胞因子和炎性介质的作用：Wang［11］等认为， TNF-α、IL-1、IL-6和IL-4是通过破坏细胞间紧密连接引起肠粘膜损伤的。本研究的结果表明，大黄素能抑制CLP后血浆TNF-α的升高，减缓CLP后大鼠肠系膜微静脉流速的下降，改善肠道微循环，减轻肠粘膜炎症损伤程度。这说明大黄素对于CLP所致的脓毒症大鼠炎症反应有抑制作用，并能通过对肠粘膜屏障的保护来减轻“二次打击”所带来的损伤。
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