乙型肝炎病毒对拉米夫啶耐药基因突变的研究
作者：林峰 曾爱平 杨宁敏 颜鸣鹤 杨恩
占世界人口5%约3.5亿人为乙型肝炎病毒（HBV）的慢性感染者［１］，在东南亚、和非洲流行率高达10%［２］。HBV感染会导致严重的肝炎，最终有可能为肝硬化和肝癌（PHC）［３］。近年来，乙肝预防和取得了很大进展，目前主要方法［２］：(1)α-干扰素；(2)抗病毒剂（核苷类似物）；(3)免疫调节疗法(包括非HBV特异性的胸腺素、白细胞介素-2、白细胞介素-12、左旋咪唑和HBV特异性的Pres或S多肽疫苗、DNA疫苗、细胞毒性淋巴细胞、抗原决定部位疫苗)。其中，拉米夫啶（lamivudine）是具有强大抑制病毒复制作用的新一代核苷类药物，继用于治疗HIV后，我国又用于治疗慢性乙型肝炎。该药可通过降低乙型肝炎病毒（HBV）依赖RNA的DNA多聚酶生物活性，明显抑制HBV-DNA的合成，具有作用强、安全、不良反应少等特点。人工合成的拉米夫啶是胞嘧啶核苷类衍生物，全称2，3-双脱氧-3硫胞嘧啶核苷，由于立体空间结构的不同，存在着两对光学异构体，其中L（-）sddc能在HBV感染肝细胞和正常肝细胞内代谢生成拉米夫啶三磷酸盐（简称3TC），后者乃拉米夫啶的活性形式，它能作用于HBV聚合酶,阻止病毒DNA的合成［３］。慢性乙型肝炎病人每日口服拉米夫啶100mg,可使血清HBV DNA迅速降低，约92%达检测水平以下，临床上拉米夫啶可用于慢性乙型病毒性肝炎（CHB）、肝硬化伴活动性病毒复制、防治肝移植时HBV的复发和无症状HBV携带者（ASC）的治疗［７］。
1 拉米夫啶抑制HBV DNA复制的机制
拉米夫啶可以明显抑制HBV的复制，一方面三磷酸形式的核苷类似物可竞争性结合至延长中的DNA链，由于其缺乏3’-OH，不能形成正常的3’，5’-磷酸二酯键，导致HBV复制的终止，通过降低HBV依赖RNA的DNA多聚酶的生物活性，抑制HBV-DNA的合成，减少受累肝细胞的cccDNA的拷贝数；另外，通过逆转机体T细胞的低反应状态，恢复T细胞活性，保护正常肝细胞，并促使受累肝细胞的翻转。
2 与拉米夫啶耐药性有关的HBV多聚酶基因区突变
HBV是部分双链DNA病毒，所以被认为较少机会出现突变［４］。但是，HBV实际上存在许多天然存在的HBV突变体，会因为应答内源性免疫压力和抗体、抗病毒治疗的选择压力而出现，长期使用可诱发HBV多聚酶编码基因区的点突变。HBV DNA多聚酶基因（P基因）编码832个氨基酸可分为4个功能区：其中氨基末端区（第1-178号氨基酸）与病毒模板的起始有关，紧接着是间隔区（第179-336号氨基酸），第3部分是多聚酶区（第337-680号氨基酸），最后为RNAseH区域（第681-832号氨基酸）［４］。Bartholomeusz等又将P基因的多聚酶的催化活性区（第421-600号氨基酸）细分为5个区域（A-E区）［５］。拉米夫啶耐药株的P基因突变多位于B区和C区，其中以C区YMDD变异最为常见，正常情况下，该区编码HBV-DNA多聚酶高度保守区酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（YMDD主型区，第738-749位核苷酸）。该区既是HBV依赖RNA的DNA多聚酶的生物活性部分，又是拉米夫啶的结合位点，还是HBV、HIV、动物hepadnavirus equivalent的逆转录酶中共同的一个高度保守区，YMDD主型区的变异必将影响拉米夫啶的抗病毒活性，从而影响治疗效果。B区和C区在与P基因重叠的HBsAg基因区的开放读码框内编码了两个跨膜螺旋（第160～184号氨基酸，第189～209号氨基酸），该区的突变也可能引起HBsAg出现突变，但没有证据表明，乙肝病毒拉米夫啶耐药株的抗原性发生了改变。与HBsAg突变体不同的是，HBV DNA多聚酶催化活性区突变体并不是出现的，而是在HBV病毒复制受到抑制（例如长时间拉米夫啶治疗）后出现，但是Whalley等［６］认为HBV 的GTG或ATT突变体在拉米夫啶治疗早期，甚至是在治疗以前就在宿主中存在。在拉米夫啶治疗过程中，野生型病毒的复制受到了抑制，因此YVDD和YIDD突变体变成了优势病毒株。拉米夫啶耐药性中P基因变异见表1。表1 拉米夫啶耐药株中P基因变异（略）
3 拉米夫啶耐药株出现情况
长期拉米夫啶治疗（>6个月），部分病人可出现两种药物耐受表现。一种是HBV DNA由阴性转为阳性，重新上升至治疗前水平称为复发；另一种HBV DNA始终维持在可检测水平以上，表现为对药物不完全应答。少数乙型肝炎病人在服用拉米夫啶36周后，在HBV P基因区开始出现YMDD的变异，以后随着服药时间的延长，变异发生率也相应增高，血清HBV DNA相应出现反跳。有报道［７］，29名HBeAg阴性病人接受拉米夫啶一年和两年治疗后，耐药株出现率为10%和56%，在HBeAg阳性和阴性的慢性肝炎病人中，与拉米夫啶耐药株的出现率相似；16%～32%的病人在用拉米夫啶治疗1年以后，出现YMDD区突变［２］，伴随着HBV DNA和ALT水平上升，而组织学检查无变化。在接受了24周拉米夫啶治疗后，HBeAg阴性、ALT水平上升、HBV DNA阳性的病人中，99%的病人出现YVDD或YIDD两者中的一种突变。Ling等报道2例慢性乙型肝炎患者进行肝移植术，口服拉米夫啶100mg/d，HBV DNA滴度维持在0.01 pg/ml，HBeAg转阴，HbsAg滴度下降，治疗后约10个月，均出现HBV DNA滴度上升至治疗前水平，HBeAg转阳，HBsAg滴度上升，延长治疗无效，P基因测序发现YMDD区域有突变，分别突变为YIDD和YVDD。Bartholomew等报道：14例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫啶100mg/d治疗>26周，治疗后2个月HBV DNA滴度明显下降，但只有9例HBV DNA持续阴性，3例仍为阳性，2例在治疗第48周时HBV DNA由阴性转阳，后5例病人P基因序列，发现3例在YMDD区域突变为YIDD，一例突变为YVDD，Bartholomew等选择其中一例复发患者的治疗前和复发后血清在体外培养系统中感染肝细胞，用不同剂量的拉米夫啶抑制HBV复制，结果发现耐药株对拉米夫啶的敏感性只有野生株的1/45。Lai等报道335例接受拉米夫啶治疗的慢性乙型肝炎患者，治疗6周时治疗组变异株发生率为4%，第52周14%，其中YIDD和YVDD变异各占一半，且25mg和100mg治疗组变异株发生率无差别，安慰组则无变异株发生。一次实验中，55例用拉米夫啶治疗2年的病人中32例出现YMDD突变，其中30例转氨酶水平上升，13例病情急剧恶化，3例肝代偿失调，但8例HBeAg得到清除。另一个研究中，52笼乙肝患者接受肝移植后，用拉米夫啶治疗，一年治疗后60%检不出HBV DNA，YMDD突变在27%病人中出现。7例病人做活组织检查发现2例无变化，2例好转，3例恶化。徐蓓等［８］发现，治疗组66例中的10例HBV DNA反跳（20pg/ml）病人中7例出现YMDD变异(5例为YVDD变异，除741位核苷酸A-G外，均伴有669位核苷酸A-C的变异，2例YIDD变异，核苷酸743G-T，其中有一例还有781T-C)，3例HBV DNA反跳未出现YMDD变异(其中2例分别有531位核苷酸G-A导致482位氨基酸天门冬氨酸-天门冬酰胺和546位核苷酸A-C导致487位天门冬酰胺-组氨酸)，治疗36周时YMDD的变异发生率为4%，52周时发生率为14%。国内报告［９］，对治疗48周的血清标本进行HBV YMDD变异的序列测定治疗组变异发生率14.6%,高于安慰剂组的5.0%,均说明YMDD的变异与拉米夫啶服药时间关系密切；治疗一年后，16%的我国病人以及30%欧、美洲病人发生YMDD突变，我国病人经3年治疗后，49%发生YMDD突变；剩下的51%病人中，有86%（相当于44%总病人数）显示乙肝病毒复制，因而可以考虑，在不能充分抑制病毒复制的病人中YMDD突变。相应地，血清中病毒的最初数量，是突变发生的危险因素，该突变型通常致病性弱，因为耐拉米夫啶的突变型发生后转氨酶和HBV DNA水平在原始值之下，也许是由于该突变型有复制缺陷，YMDD突变型的发生，会导致肝炎恶化，在免疫活性病人随后发生HBeAg血清转化。YMDD突变后的严重病程，迄今主要见于移植病人中，这可能由于移植后使用乙肝高免疫球蛋白（HBIg）进行被动免疫预防所引起的某些选择性突变，与拉米夫啶治疗诱发的突变有关，拉米夫啶似乎有利于其中某些复合性突变的复制有关。
4 HBV突变体的耐药能力比较
Fischer等通过定点诱突技术构造了鸭肝炎病毒（duck hepatitis B virus,DHBV）YMDD区域512位M-V突变，突变株在40μg/ml拉米夫啶作用下抑制病毒复制作用才80%，而2μg/ml拉米夫啶抑制野生株复制达92%。根据实验的结果［１］，几种HBV突变体对拉米夫啶的抗药性按以下次序逐渐增强（用其LC50的倍数衡量）：野生型（敏感）—L526M（18倍）—M550V（153～333倍）—M550I=L526M+M550V=L526M/M550I（>10,000倍）。 Ono-Nita等［７］将7种含不同类型HBV-DNA变异体的重组质粒分别转染人肝细胞，培养后发现以A（丙氨酸）、L（亮氨酸）代替YMDD主型区的M（蛋氨酸）时，HBV继续对拉米夫啶保持敏感；以I（异亮氨酸）、V（缬氨酸）替代时，产生拉米夫啶耐药性；而以K（赖氨酸）、R（精氨酸）、T（苏氨酸）替代时，HBV-DNA在人肝细胞中基本丧失复制能力。由此可见，YMDD主型区的变异带来的是拉米夫啶与HBV逆转录酶亲和力下降问题。
5 HBV突变体的生存能力
L528M/M552V、M552I和L528M/M552I变异形式均已在病人血清中发现，对拉米夫啶的抗性很强。前两者在病人血清中找到，但M552V从未在病人血清中被分离，暗示在体内这种突变体有某些缺陷，因为抗药性突变型HBV的复制效率低于野生型，所以不连续服药时野生型病毒会迅速替代突变型。这些野生型病毒来自原来残存的病毒，而不是变异株的回复，因此，不应停止拉米夫啶的［２］。
6 HBV 耐药株与HIV 耐药株的关系
所有的逆转录病毒的多聚酶都有YMDD保守区［５］。有趣的是，HIV 的YMDD突变株也对拉米夫啶（3TC）有抗性［３］。HBV耐药株出现的时间（以月）比HIV耐药株的（以天计算）要晚得多，这可能是因为在P基因突变位点上还有另外一个开放读码框，以致突变株活力下降。HBV 拉米夫啶耐药株与HIV 3TC耐药株在基因型和表型方面有重要的区别，虽然两者均在YMDD区的M位点发生突变。在HIV中，M184I突变体的耐药性比M184V突变体要低，两者相差2倍，而根据Allen 等的实验结果，在HBV中，M550I和L526M/M550V两种突变株的耐药性相若。
7 HBV 拉米夫啶耐药基因检测方法
随着HBV治疗药物Lamivudine的广泛使用，HBV耐药现象的出现已成为临床应用的一个棘手问题。有效测定HBV耐药相关DNA突变成为指导HBV临床用药，提高治疗效率，降低费用的重要手段。随着HBV耐药机制研究的深入，已发现HBV DNA聚合酶基因中多个点突变与Lamivudine临床抗药性正相关。HBV耐药分子机制的逐步阐明为从分子水平上研究和开发耐药基因检测新方法提供了理论基础。目前，最常用的HBV耐药基因诊断方法是DNA测序法，但该方法操作烦琐、技术难度大、要有特殊仪器；另一缺点是不能实现高通量和并行性处理多个样品。对此Stuyver等报道了一种基于核酸固相杂交的检测HBV耐药突变的线形探针测定法(Line Probe Assay,LiPA)，其主要特征是可以同时测定多个 HBV耐药突变位点(如528,552,555位)，但仍有操作复杂、探针用量大、成本高等缺点。现研究设计制备了一种HBV DNA及拉米夫啶耐药检测寡核苷酸基因芯片，其特点是能同时测定多个耐药突变位点，而且随着新的HBV耐药突变位点的不断发现可以把检测HBV耐药相关新突变的探针加到该芯片上，真正实现一种芯片能测定HBV各种可能耐药突变的快速和高通量的策略。
8 展望
核苷类似物的发现是治疗乙型病毒性肝炎的一大突破，有望成为彻底治愈慢性乙型病毒性肝炎的手段，但长期用药过程中耐药性的产生妨碍了临床应用，如何根据YMDD主型区的变异形式，筛选、联用新的核苷类似物或其他免疫抑制机，值得深入探讨。研究耐药性的产生、HBV逃避抗病毒药物的机制以及突变株的分子生物学特性，将有助于更好的检测方法和更有效的抗病毒药物，这将成为乙型病毒性肝炎治疗研究的热点之一。
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