牡蛎壳材料的生物相容性研究
碳酸钙为主体的生物材料因其自身的Ca2+，CO32-是存在于正常人体体液中，具有良好的生物相容性，与人体骨成长过程有类似性。近几年来成为骨组织支架材料研究的新热点。Science报道牡蛎壳的形成与珊瑚形成以及人体内骨盐沉积有高度相似性，研究采用亚洲沿海牡蛎，证实牡蛎壳的形成也是由粒细胞不断分泌的无机盐堆积而形成的矿物质盐［２］，这就为将资源丰富的牡蛎壳开发成为具有良好性能的骨组织工程修复材料提供了理论上的可能。作者通过倒置显微镜观察和MTT检测，将牡蛎壳材料进行体外细胞相容性试验，评价其生物相容性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
(1)牡蛎壳材料的制备：取乐清湾无污染海域的近江牡蛎壳，物理清洗干净后风干，弱酸中浸泡2h并流水冲洗24h后自然风干。将牡蛎壳碾碎至0.5cm×0.5cm大小。试验前121℃高压灭菌20min备用。(2)细胞：鼠原代骨髓基质干细胞，SD大鼠由温州医学院动物中心提供。(3)培养液：DMEM（Gibco）；胎牛血清（Gibco）。(4)主要试剂：MTT（Sigma）全称为溴化－3－（4，5－二甲基噻唑基－2）2，5－二苯基四唑，使用浓度5mg/ml，试验前新鲜配制，过滤去菌；DMSO（Sigma）。
1.2 设备
倒置显微镜（Olympus 日本），分光光度仪（Microplate Reader 日本）。
1.3 试验方法
(1)材料浸提液制备［３］：将牡蛎壳颗粒在超净台中置于无菌试管内，浸液与材料表面积之比为0．55ml/cm2的比例加入DMEM培养液（含10％胎牛血清，1％青链霉素，10 nmol/L 地塞米松，50 mg/L 维生素C，10 mmol/L B－甘油磷酸钠），置于37℃环境下3d，即得材料浸提液。(2)原代骨髓基质干细胞培养：取SD大鼠股骨、胫骨于DMEM培养液中浸泡，低速离心后取上清液。置于DMEM条件培养液（10％胎牛血清，1％青链霉素，10 nmol/L 地塞米松，50 mg/L 维生素C，10 mmol/L B－甘油磷酸钠），于CO2培养箱中培养，隔3～5d换液。待骨髓基质细胞贴壁生长致瓶底80％面积时传代。钙－钴法染色爬满原代骨髓基质细胞的盖玻片，光镜观察绝大多数细胞胞浆内可见均匀分别的棕褐色颗粒，说明碱性磷酸酶染色阳性。(3)细胞接种培养：取传3代骨髓基质干细胞，用0．25％胰蛋白酶消化，调整细胞数使其密度达到104/ml。取96孔培养板3块，均设阴性对照组和试验组，每孔加入细胞悬液100μl，放入CO2培养箱中培养24h，使细胞贴壁。试验组加材料浸提液100μl，阴性对照组加100μl DMEM条件培养液，使孔内最终浓度为50％，每块板复合8孔，放入CO2培养箱继续培养。(4)形态学观察及MTT检测：培养后2、4、6d各取1块96孔培养板，倒置显微镜观察活细胞形态。加入5mg/ml MTT 20μl继续培养4h，吸出各孔培养液, 加入二甲基亚砜(DM SO ) 100μl /孔,经微型混合振荡器振荡10min, 用分光光度仪于490 nm 处测定各孔吸光度值(OD ) 。
1.4 统计学处理
采用SPSS 13.0软件，将同一时间组间吸光度值作方差分析和均数间两两比较。通过吸光度值绘制细胞增值曲线，细胞相对增殖率（RGR）。计算公式：RGR＝（试验组X / 阴性对照组X）×100％，根据6级毒性评分标准，转换成毒性级［４］。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
2d试验组细胞基本贴壁生长，折光性良好，可见少量悬浮死细胞，对照组细胞形态正常，也可见少量悬浮死细胞；4d试验组细胞贴壁生长良好，形态呈梭形，数目增加明显。对照组细胞形态正常，数目增加；6d试验组细胞大量呈梭形生长，排列密集，对照组细胞形态正常，密集排列生长。
2.2 MTT法检测结果见表1，RGR及毒性级别见表2，细胞在材料浸提液中的生长曲线见图1。表1 试验组和对照组吸光度值（略）表2 细胞相对增殖率（％）和毒性级别（略）
2.3 统计结果
阴性对照组和试验组组间差异无显著性(Ｐ＞0.001)。
3 讨论
关于牡蛎作为生物材料的报道最早是在1965年，研究表明将其植入小鼠体内没有任何不良反应［５］。将牡蛎作为原始材料加工成为牡蛎碳酸钙补钙剂于1997年经美国FDA批准，2002年牡蛎钙获得国家卫生部批号。体外实验证实处理过的牡蛎壳具有良好的生物材料活性［２］。牡蛎壳表面的多孔结构形成材料的三维通道，增大了材料与受植区组织器官的界面，有利于加速界面结合的反应过程，为新骨组织长入材料中提供通道和容纳场所，并为携带骨诱导物质(BMP、骨髓)提供空间。经过粉碎等加工处理后，其仍然具有较好的生物活性。Currey JD等［６］测定牡蛎壳的强度数据与中牛的皮质骨相似，远远高于滨珊瑚，说明其具有较好的皮质骨替代潜能。
骨生物材料应用于临床的最基本条件是对人体无害，生物相容性好。体外细胞复合培养常被用以考察材料生物相容性的优劣，它与体内试验相比具有试验周期短、耗费少、试验条件因素容易控制、重复性良好、灵敏度高等优点。不过由于体内外细胞生存的环境存在一定的差别，因此所得的结果也可能有差异。尽管如此，它仍不失为一种有效的方法。作者吕晓迎［７］的方法制备材料浸提液，采用MTT法评定牡蛎壳材料的生物相容性。从统计结果、细胞形态学分析和材料毒性评级均表明：牡蛎壳材料具有较好的生物相容性，对骨髓基质干细胞的生长无抑制作用。因此牡蛎壳材料有望成为新型骨组织工程多孔支架材料，本试验结果也为牡蛎壳材料的进一步研究奠定了基础。
【参考文献】
1 Velich N, Szabo G. Bone substitution and remodeling of the jaw bones.Fogorv Sz， 2003，96(4):165～169.
2 Mount AS, Wheeler AP, Paradkar RP, et al. Hemocyte-mediated shell mineralization in the eastern oyster.Science， 2004，304(5668):297～230.
3 韩雪，杨晓东. 纳米复合烤瓷材料的生物相容性试验. 医科大学学报, 2001,30:105～107.
4 汤苏阳，艾玉峰，董兆麟，等. 新型生物降解材料聚β羟基丁酸的细胞毒性评价. 第四军医大学学报, 2000,21:760～761.
5 Imkiss K. The organic matrix of the oyster shell.Comp Biochem Physiol， 1965，16(4):427～435.
6 Currey JD, Zioupos P, Davies P, et al. Mechanical properties of nacre and highly mineralized bone. Biol Sci， 2001，268(1462):107～111.
7 吕晓迎， KappertHF.牙科材料细胞毒性评定的新方法.中华口腔医学杂志,1995,30(6):377～379.
