血管紧张素Ⅱ受体1和受体2在小鼠肾小管发育中的表达

                              作者：冯勇, 陆建成, 于嵩, 李晓明 

【摘要】  目的 探讨血管紧张素Ⅱ受体1(Angiotensin Ⅱ receptor type 1，AT1R) 和受体2（(Angiotensin Ⅱ receptor type 2，AT2R)在小鼠肾小管发育中的表达及其与肾脏发育的关系。方法 采用免疫组织化学方法和体视学方法检测胚龄14、15、16、18天胎鼠及生后1、3天仔鼠肾小管AT1R和AT2R的表达。结果 AT1R于胚龄15天开始出现在肾小管，胚龄16天达到高峰，随后表达逐渐减弱，生后3天微量表达；AT2R于胚龄16天开始出现在肾小管，胚龄18天达到高峰，以后表达逐渐减弱，至生后3天基本消失。结论 小鼠肾脏发育早期AT1R和AT2R与肾小管的增殖和分化密切相关。

【关键词】  血管紧张素Ⅱ受体1； 血管紧张素Ⅱ受体2； 小鼠； 肾小管； 体视学

    Abstract: Objective  To observe the expression of angiotensinⅡAT1 receptor and angiotensinⅡ AT2 receptor in tubules and investigate the relationships between them and kidney development in mouse. MethodsThe expression of AT1 receptor and AT2 receptor was examined and analyzed in the kidney of mouse embryos  at 14 d, 15 d, 16 d, 18 d, 16 d by immunohistochemistry. Results  At E15, AT1 receptor emerged. At E16, the expression of AT1 receptor  was highest and then decreased gradually. At E16, AT2 receptor emerged. At E18, the expression of AT2 receptor  was most abundant and then decreased gradually. Conclusions  It is supposed that the expression of AT1 receptor and AT2 receptor appears to correlate with the differentiation and proliferation of of renal tubules during development of mouse kidney.

    Key words: angiotensinⅡ receptor 1; angiotensinⅡ receptor 2; mouse; tubule; stereology

    近年来研究证实，血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是肾素?血管紧张素系统中最重要的活性肽，在肾脏的发生发育中起着非常重要的作用［1］。AngⅡ主要通过与它的受体结合发挥生物学功能，现在已经明确的受体主要有血管紧张素Ⅱ受体1 (angiotensin Ⅱ receptor type1，AT1R)和受体2(angiotensin Ⅱ receptor type2，AT2R)［2］。已有研究证实AngⅡ对肾小管有促增长、调亡的作用。但AngⅡ是与何种受体结合所发挥的这些作用还未明确。本实验应用免疫组织化学技术并结合体视学方法观察AT1R和AT2R在小鼠早期肾小管发育中的表达，探讨AT1R和AT2R在早期肾小管发育中的作用机制。

    1  材料和方法[*2]

     1.1  材料    25～30 g的成年健康雌、雄性昆明系小白鼠24只，由锦州医学院实验动物中心提供；抗AT1R、AT2R多克隆抗体、SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

    1.2  标本制备

    昆明系小白鼠雌、雄（3∶1）同窝饲养。见雌鼠阴道栓出现计为胚龄（embryonic days，E）0 d。选取胚龄14 d、15 d、16 d、18 d的胎鼠及生后日龄1 d、3 d的仔鼠处死后剖腹取出肾脏，10%福尔马林溶液固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，切片5 μm。

    1.3  AT1R和AT2R免疫组织化学染色 (SABC法)    将切片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，进行免疫组织化学染色。染色步骤如下： 二甲苯脱蜡，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，枸橼酸盐煮沸，正常山羊血清封闭，一抗（工作浓度1∶150）湿盒中4℃过夜，二抗37℃孵育30 min，SABC37℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。以PBS代替一抗作阴性对照。

    1.4  体视学测量 

    每个动物的肾脏系统随机选取5张切片，每张切片在油镜下按“S”形等间隔选取视野，采用方格测试系统，交点计数法测算AT1R和AT2R在肾小管细胞阳性表达的体积密度（Volume density），参照系为肾皮质，公式为Vv = Pi/Pc, 其中Pi为测试系统落在阳性细胞上的点数，Pc为落在肾皮质上的点数。

    1.5  统计学处理 

    应用SPSS软件进行方差分析， P<0.05认为有显著性差异。

    2  结果[*2]

     2.1  免疫组织化学染色结果    AT1R和AT2R在小鼠肾小管中有不同程度的表达。细胞膜和细胞浆呈现不同程度的棕黄色为阳性结果(照片1～2)。

    2.2  体视学测量结果

    AT1R于胚龄15天开始出现在肾小管，胚龄16天达到高峰，Vv（%，±S）为（16.16±0.23），以后表达逐渐减少，生后3天微量表达；AT2R于胚龄16天开始出现在肾小管，胚龄18天达到高峰，Vv为（19.19±1.23），以后表达逐渐减弱，至生后3天基本消失。AT1R和AT2R在小鼠早期肾小管发育中表达的体积密度见（表1，图1）。表1  肾小管发育不同时期AT1R和AT2R表达的含量(体密度值

    3  讨论

    AngⅡ的生物学效应是与其受体结合实现的，AngⅡ的特异受体主要有AT1R和AT2R。AT1R和AT2R均属于G蛋白偶联受体［3］，AT1R由359个氨基酸构成，其基因定位在染色体3q2123q25。而AT2R由363个氨基酸构成，其基因定位在X性染色体。AT1R和AT2R只有30%的序列同源性，因而有着各自的信号传导通路和功能［4］。已有研究证实AngⅡ对肾小管有促增长、调亡的作用。但AngⅡ是与何种受体结合所发挥的这些作用还未明确。本实验应用免疫组织化学技术并结合体视学方法观察AT1R和AT2R在小鼠早期肾小管发育中的表达，探讨AT1R和AT2R在早期肾小管发育中的作用机制。

    哺乳动物的肾脏起源于后肾组织，即输尿管芽及其诱导的生后肾组织。生后肾组织是早期集结在输尿管芽周围的细胞和细胞间质，它诱导输尿管芽不断延长、反复分支，最终发育为集合管、肾盂和输尿管。反之，输尿管芽又诱导生后肾组织分化形成肾小球和肾小管，并进一步发育为肾单位［5］。我们的研究结果表明，在胚龄16天的皮质肾小管中，AT1R含量达到高峰。此时，输尿管芽逐渐诱导生后肾组织分化形成肾小球和肾小管，所以皮质中可见发育中的各期肾小体，包括小泡体、逗号小体、S小体以及大量成熟的肾小体和肾小管。即随着肾小体和肾小管不断分化和成熟，AT1R较多出现在皮质肾小管。所以我们推测AT1R与肾小管的增殖和分化密切相关。Sequeira Lopez等的研究证实，AngⅡ具有促进细胞增殖的作用［6］。据此推测，AngⅡ的促增殖作用是由AT1R来介导完成的。细胞增殖与凋亡贯穿于生物个体发育的全过程，我们以往的实验结果表明肾小管的发育过程是增殖和凋亡共同作用的结果，即先出现增殖高峰，之后出现凋亡高峰，晚期两者活动均减弱［7］。AT1R于胚龄16天时达到高峰，AT2R则于胚龄18天达到高峰，以后表达均逐渐减弱。这似乎说明AngⅡ是通过AT2R调节肾小管发育中的细胞凋亡。这同Helmy M［8］等人研究AT2R具有调节凋亡的功能是一致的。

    在肾脏发育中AngⅡ的促生长作用主要是通过AT1R来介导完成的，而AT2R在肾脏发育中的作用目前尚不完全清楚。我们相信随着分子生物学技术的广泛应用，AngⅡ及其受体在肾脏中功能研究的深入，将会为肾脏疾病的提供新的途径和方法。

【】
  ［1］Podhorska?Okolow M， Dziegie P， Gomulkiewicz A， et al. Exercise?induced apoptosis in rat kidney is mediated by both angiotensin II AT1 and AT2 receptors ［J］. Histol Histopathol， 2006， 21(5)： 459-466.

　　［2］Lorell B H. Role of angitensin AT1 and AT2 receptors in cardiac hypertrophy and disease ［J］. Am J Cardiol， 1999， 83(12)： 48-52.

　　［3］Baiardi G， Macova M， Armando I， et al. Estrogen upregulates renal angiotensin II AT1 and AT2 receptors in the rat. Regul Pept， 2005， 124(1-3)： 7-17.

　　［4］Norwood V F， Craig M R， Harris J M， et al. Differential expression of angiotensin II receptors during early renal morphogenesis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol， 1997， 272(2)： R662-R668.

　　 ［5］李晓明， 臧东钰， 郭敏. 细胞增殖与凋亡在小鼠生后肾脏髓质发育过程中的意义 ［J］. 体视学与图像分析， 2005， 10(2)： 82-85.

　　 ［6］Sequeira Lopez M L， Maria Luisa S， Ariel Gomez R， et al. The role of angiotensin II in kidney embryogenesis and kidney abnormalities ［J］. Current Opinion in Nephrology and Hypertensi， 2004， 13(1)： 117-122.

　　［7］李晓明, 臧东钰, 郭敏. 细胞凋亡与增殖细胞核抗原在小鼠生后肾脏皮质发育中的表达 ［J］. 中国体视学与图像分析， 2006， 11(2)： 88-91.

　　［8］Helmy M Siragy， Chun Xue， et al. Angiotensin Subtype?2 Receptors Inhibit Renin Biosynthesis and Angiotensin II Formation ［J］. Hypertension， 2005， 45(1)： 133-137.