电磁脉冲辐照对小鼠血?睾屏障早期影响及TGFβ3表达意义

                 作者：彭页，程义成, 梅盛林, 张远强 张金山, 侯武刚

【摘要】  目的 探讨电磁脉冲（EMP）辐射后小鼠血?睾屏障的结构和通透性早期损伤及TGFβ3在其中的作用。方法 常规HE染色和硝酸镧示踪电镜技术观察400 kV/m电磁脉冲辐射后2～48 h内小鼠睾丸血?睾屏障结构和通透性的动态改变；免疫组织化学染色和图像分析技术检测TGFβ3在不同时间的表达。结果 400 kV/m电磁脉冲辐射后48 h内生精细胞变性、凋亡与坏死逐渐增多，支持细胞及其紧密连接发生形态变化，血?睾屏障结构损伤，各时间点TGFβ3表达强度（灰度值）持续性显著增强（均P<0.05），提示其通透性明显升高，于辐照后2 h即见发生。上述血?睾屏障的结构和通透性变化的时间和程度具有一致性。结论 EMP辐射后早期小鼠血?睾屏障的结构和通透性迅速发生损伤，TGFβ3可能在其损伤中发挥重要作用。

【关键词】  电磁脉冲；辐射；硝酸镧；睾丸；TGF?β3

    Abstract: Objective  To study the early influnce of blood?testis barrier induced by electromagnetic pulse irradiation in mouse and the mechanism of action of TGFβ3 expression in this process. Methods  Routine HE staining and lanthanum tracing electron microscopy were used to observe the influence of 400 kV/m electromagnetic pulse irradiation on mouse blood?testis barrie within 2～48 h. Immunohistochemical method and image analysis were used to analyze the possible role of TGFβ3 in this process. Results  After 400 kV/m electromagnetic pulse irradiation, spermatogenic cells presented degeneration, apoptosis and necrosis, the shape and structure of Sertoli’s cell and tight junction were changed, blood?testis barrier was injuried seriously and its permeability increased within 48 h. TGF?β3 mainly expressed in the cytoplasm of Leydig’s cells and interstitial tissue, and its expression persistently increased within 2～48 h（P<0.05）. Conclusion  The structural and functional damages of mouse blood?testis barrier rapidly occurred  after electromagnetic pulse irradiation, and TGFβ3 may play an important role in this damaging process.

    Key words: electromagnetic pulse radiation；lanthanum；testis；blood?testis barrier; TGFβ3

    电磁脉冲（Electromagnetic pulse，EMP）是一种高能、超宽频谱电磁波，在未来民用和军事领域均会有广泛的运用，其生物学效应已受到各国学者广泛的关注［1］。睾丸是EMP高度敏感器官之一［2］。既往研究大多侧重于睾丸生精上皮和间质细胞，且多仅为中晚期损伤效应，迄今罕有对血?睾屏障影响的报道。本研究采用常规苏木精?伊红染色（Hematoxylin?Eosin staining, HE）、硝酸镧示踪电镜，观察400kV/m电磁脉冲辐射后2～48 h内小鼠睾丸血?睾屏障结构和通透性的变化，并结合TGFβ3（transforming growth factor beta 3）在小鼠睾丸内表达的变化，分析其在小鼠血?睾屏结构改变中可能的作用，为电磁脉冲辐射对生殖器官的损伤与防治提供理论基础。

    1  材料和方法[*2]

    1.1  试验动物与分组    8周龄Balb/c雄性小鼠30只，体重（25±1）ｇ，本校试验动物中心提供。随机分为400 kV/ｍ辐射组与对照组各15只。各组小鼠分别在辐射后2, 6, 12, 24和 48 h随机各取3只处理。

    1.2  照射条件

    将辐射组小鼠分别装入有机玻璃盒内，垂直置于辐射场中，接受场强为400 kV/m全身照射，前沿3 ns，脉宽340 ns，脉冲间隔25 s，共计200个电磁脉冲，对照组小鼠也置于同样的环境中假照射。

    1.3  实验方法及步骤[*2]1.3.1  HE染色与电镜观察      辐射组与对照组小鼠分别于辐射后上述五个时间点各取3只，在戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/Kg）麻醉下，取双侧睾丸，左侧睾丸固定于Bouin’s液24 h，常规脱水石蜡包埋，连续切片（4 μm），裱贴于三?氨丙基三乙氧硅烷（3?Mino propyltriethoxy silane, APES）处理过的载波片上，行常规HE染色；右侧睾丸迅速固定于镧醛固定液，随即切为1 mm2大小继续固定2 h，用含镧的0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液浸洗3次，每次10 min，然后用不含镧的10 g/L四氧化锇（OsO4）固定2 h，经二甲砷酸钠缓冲液浸洗后常规电镜梯度丙酮脱水，Epon?812包埋，LKB?NoVa型超薄切片机切片，用JEM?2000EX型电镜观察［3］。

    1.3.2  TGFβ3免疫组织化学ABC法［4］

    石蜡切片常规脱蜡后入3%甲醇?H2O2封闭内源性过氧化物酶30 min；1%山羊血清室温孵育30 min封闭背景IgG，倾去血清，加TGFβ3兔抗多克隆抗体（1∶100），4℃冰箱孵育过夜；生物素标记二抗（羊抗兔IgG, 1∶300）室温2 h；ABC复合物（1∶200）室温1 h；镜下掌握DAB显色；以上各步间均用0.01 Mol/L PH7.3 PBS冲洗5 min×3次，脱水透明封片（部分切片苏木精复染8～10 s）。阴性对照用PBS代替一抗，其他步骤同上。

    1.3.3  图像分析

    各组随机选取5张TGFβ3免疫组织化学切片，在图像分析仪下(Zeiss)测量灰度值，重复5次。以相应背景灰度值减去各次测量灰度值后的平均值作为该时相该型生精细胞的最终灰度值［5］，结果以X±S表示，采用Excel统计软件作折线图，直观反映TGFβ3表达的变化，采用SPSS11.5统计软件进行数据处理，用方差分析统计不同时期间差异。

    2  结果[*2]

     2.1  HE染色观察    HE染色结果显示，正常对照组生精小管内生精上皮排列规则，无明显生精上皮的脱落、坏死（图1）。在400 kV/m电磁脉冲辐射组，辐射后2 h即可见生精小管管腔内生精细胞变性、少数凋亡、坏死及脱落，以精母细胞居多，基底室内出现细胞缺损，伴精原细胞核浓缩，支持细胞胞核明显缩向基底面，并与生精细胞相分离；辐射后6 h,12 h和24 h，以上现象有加重的趋势；辐射后48 h，部分生精小管内出现基底室与近腔室的分离，生精小管基膜不同程度增厚，局部缺损，间质水肿，毛细血管轻度扩张，内皮细胞核浓缩变性，基底膜轻度增厚，显示血?睾屏障结构明显损伤（图2）。

    2.2  电镜观察

    在正常对照组，各级生精细胞、支持细胞和紧密连接结构清晰，镧颗粒在生精小管沉淀于基膜和基底室内精原细胞与细线前期精母细胞间（图3）。在400 kV/m电磁脉冲辐射组，各级生精细胞不同程度胞核浓缩变性，少数细胞呈现凋亡图象（核染色质浓缩边集，沿核膜呈圆环形或半月形），或坏死，尤以精原细胞和精子细胞为明显，同时，支持细胞紧密连接部分结构裂解破坏，或模糊不清，并见镧颗粒更广泛沉淀于各级生精细胞间，其中辐射后2 h即可见到镧颗粒突破支持细胞紧密连接，在近腔室内精母细胞、圆形精子细胞、精子间均可见沉淀（图4）；辐射后6 h,12 h,24 h和48 h，在生精小管内还可见逐渐增多的凋亡与坏死的生精细胞，以细线前期精母细胞与晚期粗线期精母细胞居多。

    2.3  TGFβ3免疫组织化学ABC法 

    在正常对照组，TGFβ3在小鼠睾丸内主要表达于间质细胞胞质，而于间质成分（如毛细血管内皮细胞、纤维细胞等）仅极弱阳性或弱阳性，在生精小管管腔内未见阳性表达（图5）。400 kV/m电磁脉冲辐射后，TGFβ3的表达明显增强，灰度值测定结果显示，辐射组各时间点均与正常对照组之间持续有显著性差异（P<0.05），但辐射后各时间点之间无显著差异(P >0.05),见表1、图6。表1  辐照后不同时间TGFβ3平均灰度值的比较

    3  讨论

    国内外研究显示，电磁脉冲辐射可对中枢神经系统、内分泌系统、心血管系统、免疫系统和视觉系统等多系统、多脏器造成损伤。对生殖系统的研究发现，小鼠接受不同强度的电磁脉冲辐射后，睾丸的各级生精上皮均遭到不同程度的损伤，其中精原细胞、精子细胞和精子是最敏感靶细胞［6］；电镜结果显示小鼠睾丸间质细胞亦遭到严重破坏［7］，属于电磁脉冲辐射高度敏感细胞之一。然迄今尚罕见有关对血?睾屏障影响，特别是辐照后早期影响的报道。

    我们的研究主要集中在电磁脉冲辐射对小鼠睾丸血?睾屏障结构及功能的早期影响，并对相关机制进行初步探讨。众所周知，血?睾屏障是睾丸的重要结构，为精子的发生提供了稳定的微环境，一旦其结构基础受到损伤，势必影响其功能，从而进一步影响到精子的发生。血?睾屏障的结构主要包括毛细血管内皮及其基膜、结缔组织、生精上皮基膜和支持细胞紧密连结。紧密连结是构成血?睾屏障的主要结构［8］。这种支持细胞紧密连结复合结构将生精小管的的生精上皮分为基底室和近腔室两部分，为研究血?睾屏障结构提供了便利。通过HE染色和硝酸镧示踪电镜，我们发现，400 kV/m电磁脉冲辐射后2～48 h内逐渐增多的大量生精细胞脱落入管腔，以细线前期精母细胞与晚期粗线期精母细胞居多；支持细胞胞核明显缩向基底面，突起明显减少，紧密连结结构发生破坏，部分生精小管内出现基底室与近腔室的分离，同时，血?睾屏障的其他结构（毛细胞血管内皮及其基膜、结缔组织、生精上皮基膜）也发生损伤；特别是辐射后2 h即可见镧颗粒突破支持细胞紧密连接，在近腔室内精母细胞、圆形精子细胞、精子间都可见沉淀。以上结果均提示，电磁脉冲辐射后48 h内，不仅生精细胞受到损伤，支持细胞也受到损害，进而影响血?睾屏障的结构，使其通透性明显升高。

    在观察到血?睾屏障结构损伤和通透性升高的同时，我们通过免疫组织化学染色及灰度值定量分析，探讨TGFβ3在电磁脉冲辐射后小鼠睾丸损伤中可能发挥的作用和机制。有报道，在体内和体外试验均证实，TGFβ3可能通过p38MAPK信号途径调节occludin，claudin?11 和ZO?1 (zonula occludens?1)蛋白的水平，从而调节血?睾屏障精密连接结构［9-11］。同时体内的研究还证实，TGFβ3可通过Ras/ERK信号转导通路调节生精上皮间的固定连接［12］。通过以上两条途径，TGFβ3从而控制血?睾屏障的开启与闭合，控制精子发生中生精细胞向管腔的运动。我们的实验结果显示，电磁脉冲后2～48 h内TGFβ3在睾丸间质细胞胞质的表达呈明显的持续性升高，其特点是发生迅速，于辐照后2 h即见显著升高（P<0.05），并与血?睾屏障结构的损伤呈同步对应。其可能的作用机制是电磁脉冲辐射后在小鼠睾丸内TGFβ3通过一系列信号转导通路，调节血?睾屏障结构的动态平衡，最大限度地维护精子的正常发生。

    综上所述，高强度的电磁脉冲辐射可迅速、直接导致睾丸支持细胞及其紧密连接形态结构的变化，引起血?睾屏障结构和功能的损伤，TGFβ3可能通过一系列信号转导通路在此过程中发挥重要作用。

【文献】
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　　［2］王德文主编. 军事病 ［M］. 北京，军事医学出版社， 2002， 248-249.

　　［3］王爽, 李学荣, 王晓峰. 用硝酸镧示踪测定大鼠脑损伤后血脑屏障通透性改变的电镜技术 ［J］. 第四军医大学学报, 1999, 20(2): 171.

　　［4］Zhang Y Q, He X Z, Zhang J S, et al. Stage?specific localization of transforming growth factorβ1 and β3 and their receptors during spermatogenesis in men ［J］. Asian J Androl, 2004, 6(1): 105-109.

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　　［7］王水明, 王德文, 彭瑞云, 等. 电磁脉冲辐射对小鼠睾丸间质细胞结构和功能的影响 ［J］. 中华男科学, 2003, 9(5): 327-330.

　　［8］高英茂, 主编. 组织学与胚胎学 ［M］. 北京. 人民卫生出版社, 2005, 310-311.

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　　［10］Liu W Y, Lee W M, Cheng C Y. Transforming growth factor beta3 regulates the dynamics of Sertoli cell tight junctions via the p38 mitogen?activated protein kinase pathway ［J］. Biol Reprod, 2003, 68(5): 1597.

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　　［12］Xia W, Cheng C Y. TGF?β3 regulates anchoring junction dynamics in the seminiferous epithelium of the rat testis via the Ras/ERK signaling pathway: An in vivo study. Dev Biol, 2005, 280(2): 321.