糖尿病大鼠肺的超微结构观察及形态计量学研究

                   作者：汤秀英，王昱，王书合，张烨，柴立军，郭晓惠

【摘要】  目的 电镜观察及定量分析糖尿病大鼠肺组织的超微结构变化。方法 采用自发的2型糖尿病OLETF大鼠模型，使用透射电镜观察摄片、图像分析仪分析及形态计量学方法研究肺泡隔内基板厚度。结果 糖尿病大鼠肺泡隔增宽。肺泡毛细血管内皮细胞基板与I型肺泡上皮细胞基板融合部及毛细血管内皮细胞基板均增厚(P<0.01)。结论 肺泡隔基板增厚是糖尿病肺特征性的超微结构变化，肺泡隔厚度增加是导致肺功能障碍的形态学基础。

【关键词】  糖尿病； 肺； 超微结构； 形态计量学

    Abstract: Objective  To observe and quantitatively analyze the ultrastructural changes of the alveolar septa in diabetic rat lungs. Methods  OLETF rats, a spontaneous type 2 diabetic animal model, were selected. The thickness of basal lamina of the alveolar septa in diabetic rats was examined by transmission electron microscopy, image analysis, and morphometry methods. Results  In diabetic rats, the alveolar septa was widened. The fused basal lamina of the alveolar capillary endothelium and type I epithelial basal lamina, the alveolar capillary endothelium basal lamina were thickened (P<0.01). Conclusion  The thickening of basal lamina of the alveolar septa is characteristic ultrastructure of the lung in diabetic rat. The increase of  alveolar septa thickness is an important morphologic basis of pulmonary dysfunction.

    Key words: diabetes mellitus; lung; ultrastructure; morphometry

    糖尿病合并症以对心、脑及肾脏等器官的影响较为严重而受到重视。自70年代起人们发现糖尿病患者肺的气体弥散功能发生障碍，但糖尿病时有无肺组织损伤尚不十分清楚。本研究采用自发性2型糖尿病OLETF大鼠（Otsuka Long?Evans Tokushima Fatty rat）模型［1］，使用透射电镜观察并定量分析其肺组织，探讨糖尿病肺组织的超微结构变化。

    1  材料与方法〖*2〗

   1.1  实验动物及方法    试验动物由日本大冢制药公司研究所惠赠，为4周龄雄性OLETF组大鼠及对照同种系同周龄雄性LETO（Long?Evans Tokushima Otsuka）组大鼠，体重110～120克。将上述大鼠饲养于北京大学医学部实验动物部2级清洁环境，普通全价饲料单笼喂养，室温23±2℃，光照与黑夜交替。8周龄时给予10%蔗糖水喂养，观察进食及饮水情况，每周称体重、记录进食量、监测血糖，至第20周处死。血糖用葡萄糖氧化酶法测定。

    1.2  电镜标本制备

    取LETO组大鼠及OLETF组大鼠各5只进行电镜观察及测量。每只大鼠取右肺新鲜组织各5块，立即固定于2.5％戊二醛溶液，再用1％锇酸后固定。梯度脱水后用Epon812包埋，每只大鼠包埋6块。超薄切片用醋酸铀及枸橼酸铅双染色。JEM?1230型透射电镜观察并照相（20000倍）。每例分别随机拍照I型肺泡上皮细胞基板融合部 (fused basal lamina, F?BL)及肺泡毛细血管内皮细胞基板(capillary basal lamina, Cap?BL)。每例每种基板各拍照10张。

    1.3  形态计量学方法

    基板调和平均厚度测量：使用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，分别对每张照片的每种基板取3个点做垂线测量，得出垂线长即该基板的厚度(Wi, i=1, 2, ...n)及各基板共测量厚度的数目(N)，然后用调和平均厚度方法分别计算出各基板的调和平均厚度(n)［2,3］，计算公式如下：n=83π×N/?ni=1(1/Wi).1.4  统计学处理

    采用SPSS10.0 统计软件完成统计分析，采用以上获得的调和平均数代表每一只大鼠每个基板的厚度。应用成组t检验对LETO组与OLETF组的F?B及Cap?BL进行比较。

    2  结果〖*2〗

    2.1  血糖测定    12周龄时，OLETF组大鼠空腹及餐后120 min血糖均显著高于LETO组大鼠，分别为6.29±0.75 vs. 4.39±0.55 mmol/L（P<0.01）和21.09±2.34 vs.10.02±1.42 mmol/L (P<0.01) ［4］。

    2.2  电镜观察

    LETO组：肺泡隔结构清晰，I型肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞扁平。观察肺泡隔内各基板，大部分为F?BL，其余基板为II型肺泡上皮细胞基板及Cap?BL。F?BL厚薄均匀(图1)。II型肺泡上皮细胞基板不连续，与周围基质分界不清。Cap?BL厚薄均匀（图２），毛细血管内皮细胞间紧密连接结构清晰。

    OLETF组：肺泡隔增宽，纤维母细胞及胶原原纤维轻度增生。F?BL增厚，部分F?BL增厚明显，增厚的F?BL或结构模糊，或F?BL分层(图3)。II型肺泡上皮细胞增生，II型肺泡上皮细胞基板增厚且厚薄不均。肺泡毛细血管扭曲、管腔不规则伴轻度狭窄。Cap?BL明显增厚且厚薄不均，结构疏松（图4）。毛细血管内皮细胞部分紧密连接结构模糊。

    2.3  基板厚度测量值

    每张照片每种基板各测量3个点的厚度，则每例每种基板共测量30个点。统计结果见表。两组比较，相应基板厚度差别高度显著(P<0.01)。表  LETO及OLETF两组大鼠基板厚度比较

    3  讨论

    OLETF大鼠是1984年日本大冢制药公司从加拿大引进的鼠种，经过兄妹间近亲交配，20周后大鼠糖尿病发生，从而建立了一种自发性2型糖尿病鼠种。因为这种OLETF大鼠自发性2型糖尿病的疾病过程与人类2型糖尿病极为相似，因而成为研究糖尿病及其并发症较好的动物模型。本实验OLETF大鼠12周的餐后2小时血糖为21.09 mmol/L，符合餐后2小时血糖大于11.1 mmol/L的大鼠糖尿病诊断标准［５］。

    本研究电镜观察显示OLETF组大鼠肺组织发生明显的超微结构变化，主要表现为肺泡隔增宽，F?BL及Cap?BL不同程度增厚。形态学测量较准确地反映了OLETF组大鼠F?BL及Cap?BL增厚的程度，与对照组LETO大鼠比较有显著性差异。

    微血管改变是糖尿病广泛发生在全身重要器官的特征性的病理变化。本研究结果显示糖尿病的肺组织亦发生明显的微血管超微结构改变［6～8］，主要的变化是肺泡隔F?BL及Cap?BL不同程度的增厚，其中以Cap?BL增厚更为显著。这种微血管基板的变化可能由糖尿病导致的微血管内皮细胞损伤及血管通透性增加而引起，糖尿病高血糖也会导致微血管基板成分发生改变，上述过程的结果将引起微血管基板增厚。由于肺泡隔F?BL及Cap?BL厚度增加，加之II型肺泡上皮细胞及胶原原纤维轻度增生等结构改变，均导致肺泡隔增宽，而肺泡隔宽度的增加使得肺泡气体弥散距离及阻力增加，肺的气体交换势必受到影响，从而提示糖尿病的肺结构变化是影响肺功能的形态学基础。

【】
  ［1］刘彦君，潘长玉. 自发的2型糖尿病动物模型——OLETF大鼠［J］. 国外医学内分泌学分册，1999，19（1）：26-29.

　　［2］郑富盛. 细胞形态立体计量学［M］.北京：北京医科大学、协和医科大学联合出版社，1989,147-150.

　　［3］申洪，沈忠英.实用生物体视学技术［M］.广州：中山大学出版社，1990,127-130.

　　［4］王昱，郭晓蕙. 胰升糖素样多肽?1对OLETF大鼠胰腺的保护作用［J］. 北京大学学报（医学版），2006, 38(4):375-380.

　　［5］Kawano K,Hirashima T, Mori S, et al. Spontaneous long?Termhyperglycemic rat with diabetic complications otsuka long?evans tokushima fatty(OLETF)strain ［J］. Diabetes, 1992, 41:1422-1428.

　　［6］Carlson E C, Audette J L, Veitenheimer N J,et al. Ultrastructural morphometry of capillary basement membrane thickness in normal and transgenic diabetic mice ［J］. Anat?Rec. 2003, 271A(2):332-341.

　　［7］Weyrand B, Jonchneere A, Fraus A, et al. Diabetes mellitus induces a thickening of the pulmonary basal lamina ［J］. Respiration. 1999, 66(1):14-19.

　　［8］Mousa K, Onadeko B O, Mustafa H T, et al. Technetium 99mTc?DTPA clearance in the evaluation of pulmonary involvement in patients with diabetes mellitus ［J］. Respiratory?med:cine. 2000, 94(11):1053-1056.