染色质浓缩对细胞核DNA含量检测的影响

            作者：魏清柱， 夏潮涌， 刘江欢  

【摘要】  目的 利用三种不同方法制备小鼠肝细胞涂片，探讨染色质浓缩对图像分析仪测量DNA含量的影响。方法 本文选取10只成年健康雄性小鼠，采用传统涂片、液基制片法和甲醛固定后液基制片法制备小鼠肝细胞涂片，Feulgen 染色，TIGER细胞图像分析仪分别测量三种涂片内肝细胞核的积分光密度、平均光密度和面积。结果 三种涂片内肝细胞核分布均匀，轮廓清晰，呈紫红色，与传统涂片法相比，液基法内肝细胞核面积明显减小，染色质高度浓缩；相同倍体的肝细胞核在传统涂片中面积最大，平均光密度最低，各倍体间的比值最接近2和4，积分光密度CV值最低（<3.5）。固定法和液基法平均光密度明显升高，各倍体间比值明显偏离2和4，积分光密度CV值>6。结论 不同制片方法可导致同一类型、处于相同功能状态的细胞核染色质浓缩程度产生明显差异，染色质浓缩可导致平均光密度值升高，积分光密度值降低，测量结果的精确性和准确性降低。

【关键词】  染色质浓缩； 图像分析仪； DNA含量； 肝细胞涂片

    Abstract: Purposes To investigate the influence of nuclear chromatin condensation on measurement of DNA content. Methods Smears of liver cells from ten rats were prepared by conventional preparation, liquid?based preparation and liquid?based preparation with Feulgen staining, taking samples from liver tissue fixed in 4% buffered formaldehyde. A TIGER image analysis system was used to measure IOD, AOD AND A value of the nuclei. Results The amaranthine nuclei had a distinct outline and distributed evenly on the slide. The area of nuclei in liquid?based preparation was much smaller and chromatin was more condensed in comparison with those in conventional smear. The nuclei in conventional smears had the largest value of area and the value of AOD, and CV of IOD, the IOD ratio among diploid, tetraploid and octaploid DNA was most close to 2 and 4, and the CV of IOD exceeded 6%.   Conclusion The same specimen may have different degree of chromatin condensation caused by different preparation procedures. Chromatin condensation can increase AOD and decrease IOD value, and finally the accuracy and precision of ICM will be decreased.

    Key words: chromatin condensation,; image analysis system; DNA content; cell smear

    以往研究发现，不同类型细胞之间及相同类型细胞处于不同功能状态时，染色质浓缩的程度有所差异，这种差异会影响DNA倍体分析结果的精确性和准确性［1～5］。我们在实践中发现，不同制片方法可导致同一类型、处于相同功能状态的细胞核染色质浓缩程度有明显差异，由此对图像分析系统测量结果精确性和准确性的影响国内尚未见相关研究，本文对此加以讨论。

    1  材料与方法

　　1.1  传统涂片制备    正常成年雄性昆明小白鼠10只，断髓，开腹，门静脉灌注肝脏，游离肝脏。将肝脏分为二部分，一部分置于筛网中，机械研磨分离肝细胞，载玻片刮取肝细胞悬液，均匀推于另一载玻片上，95%乙醇固定15分钟。

    1.2  液基细胞学标本制备

    载玻片刮取肝细胞悬液，将其置于保存液（美国利普液基系统）中振荡，反复多次。取3.0 ml保存液放入试管中，加入5.0 ml清洁液，离心后倾倒液体，在沉淀物中加适量细胞基液，同一张载玻片上制得二个直径2.0 cm细胞薄片。

    1.3  甲醛固定后液基细胞学标本制备

    将剩余肝脏置于10%福尔马林溶液中固定24小时，固定后肝脏置于筛网中，机械研磨分离肝细胞，PBS缓冲液冲洗，游离肝细胞收集于筛网下烧杯中，取5.0 ml左右肝细胞悬液放于试管中，离心后倾倒液体，沉淀物中加适量细胞基液，同一张载玻片上制得二个直径2.0 cm细胞薄片。

    1.4  Feulgen染色

    取上述三种肝细胞涂片，流水冲洗，5N HCl水解50分钟，Schiff?s试剂染色60分钟，温度为25～30℃，0.5%偏重亚硫酸钠漂洗1分钟×3次，自来水冲洗5分钟，蒸馏水漂洗3分钟×3次，常规脱水封片。

    1.5  肝细胞核参数的测量

    按柯勒照明要求调整OLYMPUS BX51 多功能显微镜光源，使用20×物镜（NA 0.5）随机摄取肝细胞涂片的聚焦图像（512×512分辨率），按TIGER细胞图像分析仪测量光密度的操作要求，测量肝细胞核的面积积分光密度（IOD）、平均光密度（AOD）和面积（A），分别二倍体（2c）、四倍体（4c）、八倍体（8c）肝细胞核的IOD、AOD和A的均值。每张载玻片中测量肝细胞核总数不少于300个，轮廓不规则的肝细胞核不予测量。

    2  结果

    三种涂片内肝细胞核丰富，三种不同面积大小的肝细胞核分布均匀，轮廓清晰，紫红色。与传统涂片法相比，液基法内肝细胞核面积明显减小，染色质高度浓缩。

    表1结果表明三种涂片均可检测出2、4、8三种倍体的肝细胞核，相同倍体的肝细胞核在传统涂片中面积最大，平均光密度最低，各倍体间的比值最接近2和4，各倍体积分光密度CV值最低（<3.5）。固定法和液基法平均光密度明显升高，各倍体间比值明显偏离2和4，积分光密度CV值>6。表1  三种涂片中各DNA含量倍体肝细胞核的IOD值及比值注：1. “S”代表传统涂片，“F”代替甲醛固定后液基细胞学涂片，“L”代表液基细胞学涂片。

    2. 2c、4c、8c之IOD分别代表DNA含量为二倍体、四倍体、八倍体的肝细胞核的DNA含量。

    3. 4c/2c 、8c/4c、8c/2c分别代表相应倍体肝细胞核DNA含量均值的比值。

    4. 括号内数值为CV值，单位%。表2  三种涂片中各DNA含量倍体肝细胞核的AOD及A 注：1. 2cAOD、4cAOD、8cAOD分别代表二倍体、四倍体、八倍体肝细胞核的平均光密度。

    2. 2cA、4cA、8cA分别代表DNA含量为二倍体、四倍体、八倍体肝细胞核的面积。

　　3  讨论

    不同类型细胞之间及相同类型细胞处于不同功能状态时，浓缩的异染色质和解浓缩的常染色质比例不同，细胞核染色质浓缩的程度会有所差异，这种差异会影响DNA倍体分析结果的精确性和准确性［1～5］。研究表明，染色质高度浓缩的细胞核如淋巴细胞具有染色强度（IOD值）增加缓慢的特点，并且相同倍体具有高浓缩染色质的细胞比浓缩程度低的细胞染色强度（IOD值）要低10%～20%，染色质浓缩已经被认为是导致所谓“比例性误差”的原因［2～5］。

    本研究结果显示，液基法中肝细胞核面积明显减少，染色质高度浓缩，IOD值下降（与传统涂片相比下降近50%），CV值增加，不同DNA含量倍体肝细胞核间的比值明显偏离2和4，测量结果的精确性和准确性明显低于传统涂片（低浓缩染色质）。上述结果表明，除不同类型细胞之间及同种类型细胞处于不同功能状态时染色质浓缩的程度有所差异之外，同一类型、处于相同功能状态的细胞核由于制片方法间的差异同样可引起不同程度的染色质浓缩，染色质浓缩会导致图像分析系统测量结果的精确性和准确性降低。

    显示细胞核DNA的Feulgen染色是一系列的化学反应过程，而非吸附性的染色过程。染色质浓缩对Feulgen染色的影响主要体现在水解和染色两个方面。浓缩的染色质导致盐酸的去嘌呤作用减弱，使细胞核中的游离醛基数量减少，同时浓缩的染色质也阻碍Schiff?s试剂与游离醛基的化学结合，导致细胞核着色强度的降低［1～3］。同一类型、相同倍体细胞核染色质浓缩后细胞核面积缩小，闪光、光衍射等物理现象对其测量结果的影响增加，也可导致其测量结果偏低［5，6］。

    本研究结果说明，不同制片方法可导致相同类型、处于同一功能状态的细胞核中染色质浓缩程度有明显差异，染色质浓缩可导致测量结果的精确性和准确性下降，在对细胞核DNA倍体进行研究时，应选择染色质浓缩程度低的制片方法。在对测量结果进行分析时，应了解本系统的AOD测量线性的最佳区间［7～10］，如果AOD值过高，应考虑染色质浓缩对测量结果的影响。不同研究结果间进行比较时，要关注制片方法间的差异对测量结果的影响。

【】
  ［1］Hardie D C, Gregory T R, Hebert PDN. From pixels to picgrams: a beginners? guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry［J］. J Histochem cytochem, 2002, 50(6):735-749.

　　［2］Schulte E KW. Standardization of the Feulgen reaction for absorption DNA image cytometry: a review［J］. Anal Cell Pathol, 1991,3:167-182.

　　［3］Duijndam W AL, Duijn P V. The influence of chromatin compactness on the stoichiometry of the Feulgen?schiff procedure studied in model films［J］. J Histochem cytochem, 1975, 23(12):891-900.

　　［4］Schulte EKW, Wittekind D H. Standardization of the Feulgen reaction: the influence of chromatin condensation on kinetics of acid hydrolysis［J］. Anal Cell Pathol, 1990,2:149-157.

　　［5］Kindermannn D, Hilgers C H. Glare?correction in DNA image cytometry［J］. Anal Cell Pathol, 1994,6:165-180.

　　［6］魏清柱, 夏潮涌, 黄中新, 等. 光衍射现象对细胞核DNA含量检测的影响［J］. 体视学与图像分析, 2001,6(2):78-82.

　　［7］魏清柱, 夏潮涌, 黄中新, 等. 肝细胞涂片在评估图像分析仪的精确性和准确性中的应用［J］. 中华病杂志, 2004, 33(6):580-581.

　　［8］夏潮涌. 肿瘤细胞核DNA含量测定与倍体分析的现状及趋势［J］. 实用肿瘤杂志, 1996, 25(3):182-184.

　　［9］Bocking A, Giroud F, Reith A. Consensus report of the European society for analytical cellular pathology task force on standardization of diagnostic DNA image cytometry［J］. Anal Quant Cytol Histol. 1995, 17:1-7.

　　［10］Puech M, Giroud F. Standardisation of DNA quantitation by image analysis: quality control of instrumentation［J］. Cytometry, 1999, 36:11-17.