急慢性应激对大鼠中枢神经肽Y腺苷酸环化酶表达的影响
【摘要】 目的 探讨急、慢性应激对大鼠行为及不同脑区神经肽Y、腺苷酸环化酶表达的影响。 方法 将30只雄性SD大鼠随机分为急性应激组、慢性应激组和正常对照组，每组10只，用强迫游泳和空瓶刺激分别制作急性和慢性应激模型，采用开野实验箱观察各组大鼠进入中央格次数、停留时间、外周格子数、修饰次数、粪便粒数；采用免疫组织化学方法检测各组大鼠神经肽Y、腺苷酸环化酶在前额叶皮质，海马CA3区，纹状体的表达水平，并进行相关分析。 结果 开野实验箱中观察各组大鼠行为学指标显示，三组进入中央格次数、停留时间、外周格子数及修饰次数比较均有显著性差异（F=2.31、2.76、4.20、4.37，P＜0.01～0.05）。神经肽Y表达水平急、慢性应激组在前额叶皮质、纹状体均显著高于正常对照组（F=7.37、4.60，P＜0.01），在海马CA3区慢性应激组表达水平显著高于正常对照组（P＜0.05），而急性应激组无显著性变化。腺苷酸环化酶在慢性应激组大鼠的前额叶皮质，海马CA3，纹状体的表达水平显著低于正常对照组（P＜0.05），而急性应激组大鼠在纹状体表达有所增加（P＜0.05）。急性应激组大鼠前额叶皮质，纹状体腺苷酸环化酶的表达和该组大鼠在开野实验箱中的停留时间，修饰次数成显著正相关（r=0.944、0.944、0.868、0.783）。 结论 强迫游泳和空瓶应激可诱导大鼠情绪障碍，神经肽Y、腺苷酸环化酶与情绪有关，前额叶皮质、纹状体腺苷酸环化酶的表达在急性应激状态的生理改变中有重要作用。
【关键词】 应激；前额叶皮质；海马；纹状体；神经肽Y；腺苷酸环化酶
【Abstract】 Objective To explore the effects of acute and chronic stress on behavior and expression of neuropeptide Y and adenylcyclase in rats′ different encephalic region. Mehtods Thirty male Sprague?Dawley rats were randomly divided into acute stress,chronic stress and control group(each n=10)，acute and chronic stress models were made with forced swimming and empty bottle stimulation separately，and frequency of getting into central grille, detention time , outer grille numbers,modifying numbers and dejecture grain number were observed with open?field experimental box;expressions of neuropeptide Y and adenylcyclase in prefrontal lobe cortex, hippocampus CA3，striatum of the groups were observed using the immunohistochemistry method and correlation analyses conducted. Results There were significant differences in frequency of getting into central grille, detention time , outer grille numbers,modifying numbers among the 3 groups(P<0.01～0.05).Expression levels of neuropeptide Y in prefrontal lobe cortex and striatum were markedly higher in both acute and chronic and in hippocampus CA3 in the chronic than in the control group(P<0.01,P<0.05) .Expressions of adenylcyclase in prefrontal lobe cortex，hippocampus CA3 and striatum were significantly lower in the chronic than in the control group(P<0.05) and those in striatum in the acute group increased(P<0.05). Expressions of adenylcyclase in prefrontal lobe cortex and striatum were significantly positively related to detention time and modifying numbers in the acute group. Conclusion Forced swimming and empty bottle stimulation could induce rats’ emotional disorder, neuropeptide and adenylcyclase are related to emotion and expressions of adenylcyclase in prefrontal lobe cortex and striatum has an important role in physio?changes in acute stress state.
【Keywords】 Stress；prefrontal lobe cortex；hippocampus；striatum；neuropeptide Y；adenylcyclase
塞里认为，每一种疾病或有害刺激都有相同的、特征性的和涉及全身的生理生化反应过程，将其称作一般适应综合症［1］。神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）是中枢神经系统最丰富的肽类，中枢NPY与癫痫、睡眠、肥胖、学习和记忆、胃肠的调整、酗酒、焦虑、抑郁的许多生理过程有关［2］。NPY作为有效的神经递质至少通过5个G蛋白偶联受体发挥生物学作用［3］。中枢NPY主要是作为抗焦虑的神经递质［4］。腺苷酸环化酶(Adenylcyclase，AC)分布广泛，主要位于细胞质膜上。G蛋白的多种活化受体与AC之间起偶联作用。然而随着研究的进一步深入，有学者提出在应激的基础上Ca2+刺激的AC与神经元的功能变化有很强的相关性［5］。有研究认为［6］，AC激动剂Forskolin作用于蛋白激酶A通路产生浓度依赖的交感神经元NPY分泌的持续刺激。许多学者依据临床上抑郁症患者用药起效的滞后性认为抑郁症发病机制与AC信号传导系统密切相关。由于前额叶皮质、海马和纹状体在应激反应中是最有可能参与的脑区，因此，研究应激反应中NPY、AC在这些脑区的表达及其表达水平与不同应激所致动物的行为学变化的相关性，对于我们理解情绪障碍的病理生理过程有重要意义。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性SD(Sprague?Dawley，SD)大鼠［许可证号SCXK(豫)2005?0001］30只，体重230 g～270 ɡ，购自河南省试验动物中心。适应性群养1 w。9：00～11：00·d-1用手抚摸大鼠背部，每只大鼠平均抚摸3 min。饲养期间通风良好，环境安静，温度适宜，光照，自由进食水。按体重随机分为正常对照组、急性应激组和慢性应激组，每组10只。
1.2 方法
1.2.1 应激模型的建立
（1）急性应激组：急性应激组开始混合饲养，于造模最后1 d做强迫游泳，参照马文涛等［7］急性应激模型，在9：00～12：00于水深30 cm，水温恒定在25 ℃的水桶中强迫大鼠游泳30 min。游泳后用烘干机把大鼠哄干，30 min后开始做开野实验观察。（2）慢性应激组：根据［8］采用空瓶应激情绪模型，大鼠单笼饲养，第1 w，每天9∶00～9∶10，21∶00～21∶10，在这两个时间段让大鼠自由饮水，其余时间不给水；第2 w～3 w，在上述两个时间段随机给予大鼠空瓶刺激和自由饮水各1次，其余时间不给水。实验过程共3 w，在整个实验过程中大鼠自由进食。（3）正常对照组，不进行任何处理，均分到两个笼中混合饲养。
1.2.2 行为学观察
自制100cm×100cm×50 cm的木质开野实验箱［9］，箱底用白线平分为25个20cm×20cm的方格，靠箱边的16个方格为边缘格，中央9个为中央格。SD大鼠行为观察时先将SD大鼠放在正中央的格子，观察大鼠在箱内5 min的行为情况。观察指标包括：（1）中央格进入次数：三爪以上跨入中央格的次数，第1次出中央格后开始记数。（2）中央格停留时间。（3）边缘格爬行的格子数。（4）修饰次数：舔食体毛，前爪竖起或者抓挠面部。（5）粪便粒数。每只大鼠实验之前先清扫箱底，每次由2人同时观察，将平均得分用于统计分析。实验室环境要求安静，光线要暗，动物抓取过程中要轻拿轻放。
1.3 主要仪器和试剂
1.3.1 主要仪器
Leica CM?1800型冰冻切片机、PIAS?2000显微图像定量分析系统、Nikon E4500照相机、Nikon Y?1Dp显微镜。
1.3.2 主要试剂
（1）AC：A cyclase 1(H?70)兔多克隆IgG（一抗），美国SANTA CRUZ公司生产；与A cyclase 1(H?70)配套试剂盒有兔Sp检测试剂盒（包括3%H2O2去离子水，封闭用正常山羊血清工作液，生物素化山羊抗兔二抗工作液，辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液），购自北京中杉金桥生物技术有限公司。（2）NPY：兔抗NPY Cat.nr.PS227 IgG（一抗），由Monosam公司生产，与之配套的试剂盒：Anti?Rabbit，HRP/DAB(Ready?To?Use)Ultravision Detection System.由labvision公司生产，购自深圳晶美生物技术有限公司。
1.4 取材和切片
各组大鼠均给予10%水合氯醛（0.5 ml·100 g）腹腔麻醉，沿胸骨柄左缘打开胸腔，输液针头刺入左心室心尖部，并用血管嵌固定，快速灌注100 ml生理盐水，剪开右心房静脉窦待流出液体变清后再快速滴入4%多聚甲醛PB溶液200 ml，持续时间大约15 min，然后断头取脑［10］，脑块修整后置于4%多聚甲醛PB溶液的棕色广口玻璃瓶中避光4 ℃条件下后固定4 h，然后再将固定好的大脑分组放入装有20%蔗糖PBS溶液的棕色广口玻璃瓶中，组织沉底后待用。在冰冻切片机冷箱中用OCT包埋剂包埋固定，连续矢状位切片，片厚5 μm，用涂有APES粘片剂的载玻片粘片。
1.5 免疫组织化学检测
（1）免疫组织化学染色过程：PBS溶液泡洗?3%H2O2孵育?PBS溶液泡洗?滴加封闭血清?相应浓度一抗?PBS溶液泡洗?生物素化二抗?PBS溶液泡洗?辣根过氧化物酶标记链霉白素工作液?PBS溶液泡洗?DAB显色?脱水透明和中性树胶封片。（2）图像分析:通过显微镜找出每组大鼠切片中前额叶皮质（FC），海马CA3区，纹状体区域分别照相，以上各部位均用20倍物镜取三个连续视野拍照求均值以代表此样本。阳性颗粒分析结果用积分光密度来表示，细胞质或细胞膜中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达细胞，无阳性反应为阴性。
1.6 统计方法
所有数据采用SPSS12.0统计软件处理。并进行单因素方差分析、最小显著差法和相关分析。P＜0.05显示有统计学意义。
2 结果
2.1 开野实验箱中三组大鼠的行为学变化比较，见表1。表1 三组大鼠的行为学变化(略)注：与正常对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与急性应激组比较*P＜0.05。
表1显示，开野实验箱中观察大鼠各行为学指标发现，三组进入中央格次数、停留时间、外周格子数及修饰次数比较均有显著性差异（F=2.31、2.76、4.20、4.37，P＜0.01～0.05）。急性应激组进入中央格次数、停留时间、外周格子数、均显著低于正常对照组（P＜0.01～0.05）；慢性应激组大鼠进入中央格次数、停留时间均显著高于急性应激组、低于正常对照组（P＜0.05），进入外周格子数、修饰次数均显著高于急性应激组（P＜0.01～0.05）。
2.2 三组大鼠不同脑区NPY的表达水平比较，见表2。表2 三组大鼠不同脑区NPY表达水平（略）
表2显示，急、慢性应激组大鼠在前额叶皮质的NPY表达水平均显著高于正常对照组（F=7.37，P＜0.01）。慢性应激组大鼠在海马CA3区的NPY表达水平显著高于正常对照组（P＜0.05）。急、慢性应激组大鼠在纹状体的NPY表达水平均显著高于正常对照组（F=4.60，P＜0.05），急性应激组与对照组比较有显著性差异（P＜0.05），慢性应激组与对照组比较有极显著性差异（P＜0.01）。急性应激组大鼠在前额叶皮质、海马CA3区、纹状体的NPY表达水平与对照组比较均无显著性差异（P均＞0.05）。
2.3 三组大鼠不同脑区免疫组织化学染色NPY积分光密度比较，见图1、图2、图3(见封三)。
2.4 三组大鼠不同脑区AC的表达水平比较，见表3。表3 三组大鼠不同脑区AC表达水平（略） 注：与正常对照组比较△P＜0.05；与急性应激组比较*P＜0.05。
表3显示，三组大鼠在前额叶皮、海马CA3区、纹状体AC的表达水平均有显著性差异（F=3.51、4.78、7.64，P＜0.01～0.05）。在前额叶皮质慢性应激组的AC表达水平显著低于正常对照组（P＜0.05），与急性应激组无显著性差异（P＞0.05）；在海马CA3区慢性应激组的AC表达水平显著低于正常对照组和急性应激组（P＜0.05），而正常对照组与急性应激组无显著性差异（P＞0.05）；在纹状体慢性应激组的AC表达水平显著低于急性应激组（P＜0.05），与正常对照组无显著性差异（P＞0.05），而急性应激组显著高于正常对照组（P＜0.05）。
2.5 三组大鼠不同脑区免疫组织化学染色AC积分光密度比较，见图4、图5、图6(见封三)。
2.6 急、慢性应激组各脑区NPY、AC指标相关分析，见表4。表4 急慢性应激组NPY及AC与各脑区相关分析（略）
表4显示，急、慢性应激组前额皮质、海马CA3区、纹状体各脑区NPY、AC表达水平的相关分析均无统计学意义。
2.7 急慢性应激组大鼠NPY及AC指标与开野实验箱行为学指标相关分析，见表5。
表5显示，急性应激组前额叶皮质、纹状体AC指标分别与停留时间、修饰次数成正相关，（r=0.944、0.944、0.868、0.783，P＜0.01～0.05），而NPY各脑区及AC海马CA3与开野实验箱行为学指标无显著相关性（P＞0.05）。慢性应激组各脑区NPY、AC指标与开野实验箱行为学指标均无显著相关性（P＞0.05）。表5 急慢性应激组大鼠NPY及AC指标与行为学指标相关分析（略）注：*P＜0.05，**P＜0.01。
3 讨论
目前，关于应激和行为的研究相当广泛，但结果尚有差异，有研究者发现母爱剥夺、社会交往剥夺等心理社会应激都能使动物在高架十字迷宫的开臂停留时间缩短，在旷场中的活动降低［11，12］。Pijlman等［13］研究发现，情绪应激增加动物旷场中的活动水平和探究行为，生理应激却引起上述行为减少。本研究显示，急性应激和慢性应激能导致大鼠情绪障碍及行为学变化，即急性应激组大鼠进入中央格次数、中央格停留时间、外周格子数明显减少，而慢性应激组大鼠进入中央格次数，停留时间明显减少，而修饰次数明显增加。本研究中急性应激方式采用了强迫游泳30 min，包含了动物在水中游泳时所受的生理应激和面对生存威胁时求生，绝望等造成的心理应激，而慢性应激采用14 次空瓶刺激，主要是通过空瓶刺激让动物产生强烈的情绪行为，本慢性情绪应激模型是一种相对纯粹的心理应激动物模型，慢性情绪应激的行为表现并没有因空瓶长达14次的刺激而改变，说明动物处于强烈的情绪应激状态。该结果可以证实该空瓶应激模型是一种稳定的慢性情绪应激模型［8］。可能由于应激源、应激方式、应激时限和评价工具的不同产生了上述结果的不一致，本研究通过不同应激方式同一开野实验箱的评定显示急性和慢性应激所造成动物的行为学是有差异的。行为学的差异在某种程度上也意味着神经生物学基础的不同。
很多证据表明，NPY是一个神经递质和神经激素和人体的应激反应复杂相关，因此被认为是“应激分子”［14］。本研究发现急性应激组在前额叶皮质，纹状体都增加了NPY的表达水平，而慢性应激组在前额叶皮质、海马CA3区、纹状体都增加了NPY的表达水平，并且两组在前额叶皮质，纹状体的表达无显著差异。有资料显示在应激的反应中，最有可能参与脑区是海马、前额叶脑皮质［15］，NPY是中枢神经系统分布最广泛的肽类，以前已经证明急性和重复应激可以调节NPY。Thorsell A等［16］认为，在社会隔离的慢性应激大鼠模型中纹状体NPY浓度表现为增加。也有资料显示在尸检损伤的大鼠模型中发现海马部位比正常大鼠的NPY水平要高［17］。本研究结果与上述相一致。由于海马CA3区在急性应激组无明显变化，而在慢性应激组的大鼠中表达中明显上升，这也可能与NPY表达的时效性未到有关，此两种应激可能产生相似性的增加还有待进一步研究。
慢性应激可能损伤海马神经元，也可改变海马功能。AC信号传导系统在海马部位［18］是神经传递的重要调质。本研究发现急性应激组在纹状体的AC表达水平增加，而在前额叶皮质、海马CA3区的AC表达水平未见明显变化。慢性应激组在前额叶皮质，海马CA3区的AC表达水平下降，在纹状体AC表达水平未见明显变化。并且慢性应激组在海马CA3区、纹状体较急性应激组均降低。有资料显示冷水游泳和束缚应激增加了AC的活动在下垂体额皮质的表达［19］，6 h的疼痛应激情绪大鼠模型AC在大脑皮质没有变化［20］。在不动应激条件下AC系统可能经历时间依赖和具体区域的变化［21］，在习得性无助大鼠的第1 d，在前额皮质、海马和纹状体Forskolin 刺激的AC活动显著降低，也表明AC的活动降低在急性抑郁状态显著，但是在后来的观察中没有观察到AC活动的变化［22］。上述结果表明，AC系统不同应激条件下经历时间依赖和具体区域的变化是值得肯定的，本研究结果也提示与近来有学者提出的抑郁症和AC活动的功能下降有关相一致。
本研究未发现急性应激组大鼠和慢性应激组大鼠前额叶皮质、海马CA3、纹状体部位NPY和AC积分光密度有相关性，NPY和AC作为应激模型密切相关的因素可能有不同的作用机制，且有学者认为NPY主要作用于大脑皮质突触小体NPY Y1受体调整谷氨酸的释放，并且和蛋白激酶C通路调整相关［23］。急性应激组大鼠AC在前额叶皮质，纹状体的积分光密度与大鼠在开野实验箱中的中央格停留时间，修饰次数成正相关。中央格停留时间反映动物的认知能力，修饰行为反映动物对于环境警觉性的高低［24］。本研究认为认知能力、环境警觉性与AC在前额叶皮质，纹状体的表达水平在急性应激状态中的相关性密切,动物行为学的这些变化也为我们进一步研究AC系统通路在情绪障碍中的作用提供了线索。
【】
［1］姜乾金.医学心［M］.北京：人民卫生出版社，2002：73
［2］Sajdyk TJ，Shekhar A，Gehlert DR.Interactions between NPY and CRF in the amygdala to regulate emotionality［J］.Neuropeptides，2004，38（3）：225
［3］Karl T，Herzog H.Behavioral profiling of NPY in aggression and neuropsychiatric disease［J］.Peptides，2007，28（2）：326
［4］Lydia E Kuo，Zofia Zukowska.Stress，NPY and vascular remodeling：Implications for stress related diseases［J］.Peptides，2007，28（2）：435
［5］Michele L Schaefer，Scott T Wong，David F Wozniak，et al.Altered Stress?Induced Anxiety in Adenylyl Cyclase Type VIII Deficient Mice［J］.The Journal of Neuroscience，2000，20（13）：4809
［6］Victor May，Cynthia A Brandenburg，Karen M Braas.Differential Regulation of Sympathetic Neuron Neuropeptide Y and Catecholamine Content and Secretion［J］.The Journal of Neuroscience，1995，15（6）：4560
［7］马文涛，杨来启，王晓峰，等.急性应激对大鼠血清细胞因子及皮质醇水平的影响［J］.中华精神科杂志，2002，35（2）：110
［8］邵枫，林文娟，陈极寰.慢性情绪应激对大鼠行为的影响及变化趋势［J］.行为医学，2003，12（1）：5
［9］韩要武，赵乐章，刘巧琼，等.条件恐惧训练对F344大鼠行为活动的影响［J］.中国行为医学科学，2004，13（6）：622
［10］包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.北京：人民卫生出版社，1991：105
［11］Wigger A，Neumann ID.Periodic maternal deprivation induces gender?dependent alterations in behavioral and endorcrine response to emotional stress in adult rats［J］.Physiology Behavior，1999，66（2）：293
［12］Lershina IP，Shuikin NV.Peculiarities of exploration behaviour of socially dep rived rats in stress situation［J］.Zh Vyssh Nerv Deiat Im IPP avlova，2002，52（5）：602
［13］Pijlman FT，Herremans AH，Kieft J.Behavioural changes after different stress paradigms：prepulse inhibition increased after physi?cal，but not emotional stress［J］.European Neurop sychopharmacology，2003，13：369
［14］Zukowska?Grojec Z.Neuropeptide Y.A novel sympathetic stress hormone and more［J］.Ann N Y Acad Sci，1995，771：219
［15］Shen C P，Tsimberg Y，Salvadore C，et al.Activation of Erk and JNKMAPK pathways by acute swim stress in rat brain regions［J］.BMCNeuroscience，2004，5：36
［16］Thorsell A，Slawecki CJ，El Khoury A，et al.The effects of social isolation on neuropeptide Y levels，exploratoryandanxiety?relatedbehaviorsinrats［J］.PharmacolBiochemBehav，2006，83（1）：2
［17］Miller CC，Holmes PV，Edwards GL.Aera postrema lesions elevate NPY levels and decrease anxiety?related behavior in rats［J］.Physiol Behav，2002，77（1）：135
［18］Wolfgang D，Chen I，Wand GS.Effects of restraint stress on components of denylylcyclase signal transduction in the rathippocampis［J］.Neuropsycho?pharmacology，1994，11（3）：187
［19］Morrill AC，Wolfgang D，Levine MA，et al.Stress alters adenylyl cyclase activity in the pituitary and frontal cortex of the rat［J］.Life Sci，1993，53（23）：1719
［20］Skurygin VP，Elizarova EP，Kurennaia GS，et al.Adenylate cyclase system of synaptosomes from the rat cerebral cortex during acute stress［J］.Voper Med Khim，1990，36（2）：45
［21］Nagata E，Fukuuchi Y，Tanaka K，et al.Immobilization stress induces alterations of second?messenger systerms in the gerbil brain［J］.Neurosci Res，1993，17(1)：31
［22］Itoh T，Abe K，Tokumura M，et al.Different regulation of adenylyl cyclase and rolipram?sensitive phosphodiesterase activity on the frontal cortex and hippocampus in learned helplessness rats［J］.Brain Res，2003，991（1～2）：142
［23］Wang SJ.Activation of neuropeptide Y1 receptors inhibits glutamaterelease through reduction of voltage?dependent Ca2+ entry in the rat cerebral cortex nerve terminals：suppression of this inhibitory effect by the protein kinse C?depent facilitator pathway［J］.Neuroscience，2005，134（3）：987
［24］Kevin D beck，Victoria N Luine.Food deprivation modulates chronic stress effects on objects recognition in male rats：Role of monoamines and amino acids［J］.Brain research，1999，830：56
