卡立泊来德对离体肺缺血再灌注损伤的初步实验研究
作者：周荣华，陈果，蒲江涛，陈艳芳，刘馨烛，张艳菊，龙村，刘斌
【摘要】 目的 研究选择性钠/氢离子(Na+/H+ )交换阻断剂卡立泊来德(Cariporide)对离体大鼠肺缺血/再灌注损伤的防治效果。 方法 建立离体大鼠肺缺血再灌注损伤模型。18只SD成年大鼠随机分为3组，每组6只：对照组:采用含5％羟乙基淀粉的KHHB(Krebs - Henseleit hydroxyethylamylopectine buffer)灌注液持续平衡灌注、通气120 min；缺血再灌注组:平衡30 min后，缺血60 min、再灌注30 min； Cariporide组:平衡15 min，给予Cariporide预处理15 min，缺血60 min、再灌注30 min。持续监测并记录肺动脉压(PAP)；留取再灌注末灌注液,测定超氧化物歧化酶(SOD) 活性和丙二醛(MDA) 含量；再灌注结束，测肺湿/干重比(W/D)；光、电镜观察肺病改变。 结果 缺血再灌注组PAP、MDA含量、SOD活性和W/D 较对照组明显升高(P<0.05)，SOD 活性显著下降(P<0.05)。Cariporide能明显减少PAP、MDA和W/D的增加，提高SOD活性(P<0.05)，显微、超微结构证实Cariporide组肺血管内皮及肺泡上皮的病理变化明显减轻。结论 Cariporide 能降低离体大鼠肺缺血再灌注损伤。
【关键词】 Na+/H+ 交换； 卡立伯来德；肺；缺血再灌注损伤
Abstract: OBJECTIVE To investigate the protective effects of selective Na+/H+ exchanger cariporide on isolated rat lung ischemia and reperfusion injury. METHODS The isolated lung ischemia/reperfusion models were established. After equilibration, eighteen adult S.D rats were randomly divided into three groups: the control group(n=6),the ischemia/reperfusion group (n=6) and the cariporide group (n=6). In the control group, the isolated rat lungs were continuously perfused with the Krebs - Henseleit hydroxyethylamylopectine buffer (KHHB) solution for 120min. In the ischemia/reperfusion group, the isolated rat lungs were reperfused for 30min after 60min of ischemia．In the cariporide group, cariporide was administered in the KHHB solution before ischemia. Pulmonary artery pressure (PAP) were continuously monitored. The KHHB solution at 30min of repefusions was collected to measure the malondialdehyde(MDA) content and superoxide dismutase (SOD) activity. After reperfusion, wet to dry lung weight ratio(W/D) was measured. The morphologic changes were also observed under light and electronic microscopes. RESULTS PAP,MDA and W/D in the ischemia/reperfusion group were significantly higher than those in the control group (P<0.05), and the SOD activity was lower than that in the control group (P<0.05). While, compared with the ischemia/reperfusion group, cariporide significantly reduced the PAP, MDA and W/D(P<0.05), and significantly increased the SOD activity(P<0.05). The morphologic and ultrastructural damages in the cariporide group were milder than those in ischemia/reperfusion group. CONCLUSION Cariporide can significantly protect lung injury induced by ischemia and reperfusion in the isolated rat.
Key words： Na+/H+ exchanger; Cariporide; Lung; Ischemia/reperfusion injury
肺缺血再灌注损伤广泛存在于临床，例如：各种体外循环手术、肺移植术、心肺联合移植术后、肺血栓内膜剥除术及肺栓塞溶栓，以肺水肿、肺动脉高压为主要表现［1］，直接影响患者预后，但无特效防治方法。已有研究表明，选择性钠氢离子交换（Na+/H+ exchanger isoform-1, NHE1）阻断剂卡立泊来德（Cariporide）能减轻心肌缺血再灌注损伤［2-3］。而肺组织中也同样存在NHE1［4-5］，Cariporide是否对肺缺血再灌注损伤存在作用，尚不清楚。本研究通过建立离体大鼠肺缺血再灌注模型，探讨Cariporide对肺缺血再灌注损伤的防治效果。
1 材料和方法
1.1 离体肺缺血再灌注模型 SD成年大鼠（雌雄不限，体重275～345 g），用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹腔注入肝素(1000 U/kg)行全身肝素化，待后爪反射消失，气管切开插管，接微型人工呼吸机（江湾Ⅰ型）行控制呼吸(呼吸频率60次/min，潮气量6 ml/min)。正中劈开胸骨开胸，游离肺动脉，套线备用。经右心室插管至肺动脉主干（20G Y型套管针），结扎固定。迅速完整取下整个心肺组织，置于Langendorff灌流装置（Bridge AD Instrument PTY Ltd, Australia）， 37℃、95%O2、5%CO2饱和的含5％羟乙基淀粉的改良KHHB(Krebs - Henseleit hydroxyethylamylopectine buffer)灌注液［6］、以30cm的高度落差经肺动脉插管非循环灌注肺脏，流量10 ml/min，并迅速剪开左心耳，以利于肺灌注液的引流。停止人工灌注和机械通气定义为：37℃常温肺缺血,保湿，缺血期肺内注入1.5 ml空气后夹闭气管；同时恢复灌注和机械通气则为再灌注，建立大鼠离体肺缺血再灌注损伤模型［6］。
1.2 实验分组 采用完全随机双盲的研究方法，成年SD大鼠18只，随机分为三组，每组6只：对照组，KHHB灌注液持续灌注离体肺120 min；缺血再灌注组，KHHB灌注液平衡灌注30 min后，常温37℃缺血60 min，再灌注30 min；Cariporide组，缺血前用加入Cariporide（德国Aventis Pham公司惠赠）的KHHB灌注液预处理15 min，然后常温缺血60 min，再灌注30 min。KHHB灌注液中Cariporide浓度为10μmol/L。
1.3 检测指标 在整个灌流过程中，用Powerlab多道生理记录仪（Bridge AD Instrument PTY Ltd, Australia, Chart v 5.0）持续监测并记录肺动脉压(PAP)。取再灌注30 min的KHHB灌注液，以硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD) 活性，SOD、MDA 试剂盒购于南京建成公司。再灌注结束，结扎左肺门，用分析天平称量左肺湿重，70℃ 24 h 烘干后称干重，两者之比为肺组织湿/干重比(W/D)。取右下肺约1cm×1cm×1cm小块肺组织，采用4%多聚甲醛固定, 脱水，石蜡包埋，切片后HE染色，光镜下观察肺形态学变化；同时取1mm×1mm×1mm 小块肺组织，3％戊二醛固定，常规脱水、包埋和切片，醋酸铀-枸橼酸铅复染，透射电镜下观察肺组织超微结构变化。
1.4 统计方法 数据均以(±s )表示，采用SPSS 11.0统计分析软件，组间比较采用方差分析和q检验，P<0.05为组间差异有显著性意义。
2 结果
2.1 再灌注肺动脉压(PAP)变化 平衡过程中，三组大鼠基础PAP值无统计学差异（P>0.05）。再灌注过程中，缺血再灌注组与Cariporide再灌注各监测时点的PAP均较正常对照组显著增高（P<0.05），但Cariporide组PAP数值显著低于同时点缺血再灌注组（P<0.05）。见图1。
图1 各组再灌注肺动脉压变化值（略）
注 * 与正常组比较P<0.05 ；＃与缺血再灌注组比较P<0.05
2.2 灌注液MDA、SOD含量和肺组织W/D
缺血再灌注组MDA、W/D较正常对照组显著增高（P<0.05），SOD活性较对照组显著降低（P<0.05）；但Cariporide组MDA、W/D显著低于缺血再灌注组（P<0.05），且其SOD活性显著高于缺血再灌注组（P<0.05）。见表1。
表1 灌注液MDA、SOD含量和肺组织湿/干重比(W/D)（略）
注：*与正常组比较P<0.05 ；#与缺血再灌注组比较P<0.05
2.3 肺组织形态学变化
2.3.1 光镜检查 对照组（图2）：肺组织结构完整, 支气管、肺泡腔及肺血管未见明显改变。 缺血再灌注组（图3）：则肺水肿明显，肺泡扩张不均匀，肺泡间隔明显增厚，肺间质和肺泡腔有较多炎性细胞渗出，肺泡腔内可见坏死脱落的上皮细胞，支气管内皮断裂、脱落。
Cariporide组（图4）：肺泡轻微扩张，肺血管内皮轻度水肿，肺间质和肺泡腔有少量炎性细胞浸润，肺损伤较缺血再灌注组明显减轻。
2.3.2 电镜检查 对照组（图5）：超微结构清晰，肺血管内皮较完整, 肺泡Ⅰ型上皮细胞、Ⅱ型上皮细胞未见明显病理变化。缺血再灌注组（图6）：肺毛细血管内皮细胞肿胀, 肺泡Ⅰ型上皮细胞肿胀变性, 核增大；肺泡Ⅱ型上皮细胞,细胞核内可见染色体边集、固缩，线粒体明显肿胀、空泡化，嵴溶解；微绒毛减少,呈空泡状改变；板层体排空明显。 Cariporide组（图7）：间质轻度水肿, 肺泡Ⅰ型上皮细胞轻度肿胀, 表面微绒毛形成指状突起, Ⅱ型上皮细胞胞浆内线粒体肿胀, 板层体少量空泡化。
图2 对照组肺组织形态学变化（HE×100）（略）
图3 缺血再灌注组肺组织形态学变化（HE×100）（略）
图4 Cariporide组肺组织形态学变化（HE×100）（略）
图5 对照组肺组织形态学变化（×6000）（略）
图6 缺血再灌注组肺组织形态学变化（×6000）（略）
图7 Cariporide组肺组织形态学变化（×6000）（略）
3 讨论
本实验肺缺血60 min后再灌注30 min，造成了缺血再灌注肺组织形态结构损害，表现为：肺水肿明显，肺组织大量炎性细胞浸润，电镜下可见肺实质细胞胞浆和细胞器肿胀、空泡变性；这种以肺毛细血管内皮细胞受损、血管高通透性肺水肿为特征的病理变化与报道的肺缺血再灌注损伤早期形态改变一致［7］。肺毛细血管内皮细胞受损还表现为肺血管阻力增高、肺动脉高压。 本实验中缺血再灌注组肺组织W/D比值及PAP显著高于对照组。 而Cariporide组缺血再灌注肺组织细胞形态结构改变明显减轻，W/D比值和PAP都显著降低，肺组织形态学改变明显减轻。 Moore TM［8］等研究显示，NHE抑制剂Amiloride通过拮抗NHE1能显著降低肺毛细血管通透系数，减轻急性肺损伤。肺缺血再灌注后肺损伤另一主要病理变化为肺表面活性物质减少、炎性细胞激活及过氧化损伤［9］。本实验中，与缺血再灌注组相比，Cariporide组光镜下炎性细胞浸润及电镜下肺表面活性物质存在形式的Ⅱ型肺泡上皮细胞板层体排空、数目减少的程度也有所减轻，且增加SOD活性、降低MDA。 综上所述，Cariporide降低缺血再灌注导致的肺动脉高压、肺水肿、过氧化损伤，减轻离体大鼠肺缺血再灌注损伤。
研究表明细胞内钙超载是导致肺缺血再灌注损伤的重要机制，传统的钙拮抗剂阻断Ca2+内流，可减少肺缺血再灌注损伤［10］。但细胞内钙超载不仅是钙离子通道本身作用的结果，事实上从病理生角度分析，细胞不同离子通道之间也具有明显的相互影响作用［11］。NHE1广泛分布在肺泡上皮细胞的基底膜［4］，在正常情况下，NHE1对调节肺泡细胞内pH梯度和细胞内Na+浓度具有十分重要的作用，从而维持肺泡细胞的各种生理功能和化学感受器的调节。NHE1每排出一个H+就有一个Na+进入细胞。细胞内H+浓度增加、细胞内外Na+浓度梯度增大、细胞内外pH梯度增大是激活NHE1的主要因素。缺血再灌注过程中细胞内酸中毒过度激活NHE1，导致细胞内Na+增加，继而激活细胞膜Na+/Ca2+交换，导致细胞内钙超载［12］。Cariporide降低肺缺血再灌注损伤的可能机制为阻断NHE1、进而降低细胞内钙超载，但关于Cariporide肺保护作用的机理有待深入研究。
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