环磷酰胺对兔离体肺保护的作用
【摘要】 目的 应用兔离体肺再灌注模型研究环磷酰胺对兔离体肺保护的作用。方法 20只实验兔随机平均分为两组，对照组术前腹腔注射生理盐水10 ml，实验组术前腹腔注射环磷酰胺50 mg/kg（溶解在10 ml生理盐水中）。48 h后进行实验，由实验兔右室流出道尽量抽取兔血，造成肺组织热缺血。1 h后以低钾右旋糖苷肺保护液（LPD）进行肺灌洗及保存，保存4 h后用开始时抽取的兔血进行再灌注。再灌注10 min、30 min、60 min分别测定肺血管阻力(PVR)、肺通气阻力(LR)、以及肺静脉血氧分压（ PvO2），再灌注结束后取肺组织进行肺含水量(LW)测定以了解肺保护效果。结果 实验组再灌注后PVR明显低于对照组(P＜0.05)，PO2明显高于对照组(P＜0.05)。LR 、LW两组无明显差别。结论 环磷酰胺对兔离体肺保存具有一定保护作用，其可能的机制是通过免疫抑制以及细胞毒作用减轻了炎性反应。
【关键词】 环磷酰胺；兔；离体肺保护
The Protective Effect of Cyclophosphamide on Rabbit's Isolated-lungs Preservation
Abstract: OBJECTIVE To study the protective effects of cyclophosphamide on isolated lungs preservation using isolated-lungs reperfusion model of rabbit. METHODS The effects of cyclophosphamide on lung preservation were studied in 20 rabbits which were randomly divided into two groups (10 rabbits in each group). The experimental group was injected cyclophosphamide to cavitas abdominalis (50mg/kg), while the control group was injected same volume of normal saline (NS). The experiment were performed at 48 h after injection. Blood were draining out through right ventricular outlet completely, to make the rabbit's heart arrest. The lungs of two groups were flushed and preserved with low potassium dextran solution after 1 hour's warm ischemia and then reperfused after 4 hours of preservation. Pulmonary vascular resistance (PVR), lung resistance (LR) and blood gas were examined after 10 min，30min and 60 min of reperfusion. Lung water (LW) content was examined after 60 min of reperfusion. RESULTS It was found that:PVR was much lower in the experimental group than in the control group (P<0.05). While PO2 was much higher in the experimental group than in the control group(P<0.05).No deference was found in LR and LW between two groups. CONCLUSION Cyclophosphamide can improve the lung preservation perhaps by inhibiting the producing of inflammatory mediator.
Key words： Cyclophosphamide;Rabbit；Isolated lungs preservation
“离体肺保护”的研究对肺移植和心肺联合移植的成功有极其重要的意义。离体肺保护的主要研究包括：①肺保护液的成分、肺灌洗方法；②低温肺保护；③膨肺时所用气体成分［1］。目前的肺保护方法虽然能够满足常规临床使用，但人们仍然在探索更好的肺保护方法。本文在以上研究范围的基础上，从其它方面研究肺保护。肺保护液对离体肺的保护作用包括以下几个方面：①能够冲走存留在肺血管床内的血细胞，尤其是白细胞、血小板；②低温肺保护液能够降低肺组织温度；③有的肺保护液含有代谢底物，能够在低温无血情况下，有限提供给肺代谢底物；④给肺组织提供良好的离子、胶体渗透压环境，以及良好的缓冲体系；⑤保护肺血管内皮细胞。所以，经肺动脉灌注肺保护液是实现良好的离体肺保护的重要、基本手段。本实验采用此方法作为离体肺保护研究的主线，但在进行离体肺保护实验之前，提前给实验动物以药物干预，腹腔注射环磷酰胺，48 h以后进行实验。以离体肺再灌注后肺功能各参数为指标来衡量肺保护效果。
1 资料与方法
1.1 实验分组 20只实验用白兔(医学院实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重（2.3±0.7）kg。随机分为两组:对照组(生理盐水组)、实验组(环磷酰胺组)。实验前48 h腹腔分别注射生理盐水以及环磷酰胺（50 mg/kg，10 ml）,48 h后进行试验。开胸后经兔右室流出道尽量抽取静脉血，造成肺组织热缺血模型。1 h后以4℃LPD液进行肺灌洗及保存。4 h后复灌。
1.2 离体兔肺的获取和保存 实验用兔使用安定、氯胺酮混合液麻醉，(10 mg安定：200 mg氯胺酮)2～3 ml/kg肌肉注射，气管切开、插管，经耳缘静脉注入2%戊巴比妥2 ml/kg，抑制兔的自主呼吸，接呼吸机(江湾I型,第二军医大学)控制呼吸,潮气量15 ml/kg，FiO221%,频率45 次/min。耳缘静脉注射肝素700 IU/kg抗凝。取胸正中切口，穿刺右室流出道收集自体血(生理盐水稀释至红细胞压积0.25，备再灌注时使用)，并切开左心耳。维持呼吸参数不变，心脏停跳后计时60 min。主肺动脉灌入4℃LPD肺保护液，维持灌注压在25 mmHg以内，直至左房引流液澄清时止，约灌注肺保护液50 ml/kg。完整切除心肺，在膨肺50%后浸入4℃保护液中保存。
1.3 环磷酰胺以及LPD液配制 ①环磷酰胺配制：50 mg/kg环磷酰胺，10 ml生理盐水溶解。②LPD液成分（mmol/L）：Na+ 141；K+ 6.4；Cl- 119；Mg2+ 5；pH 7.6；葡萄糖10g/L；低分子右旋糖苷10g/L。
1.4 离体肺的再灌注［2］及观察指标 离体肺保存4 h后取出复灌,支气管插管接呼吸机, 潮气量15ml/kg,FiO221%,频率45次/min,同时以自体血在37℃时用滚压泵(STOCKERT)以20 ml/min流量灌注,再灌注10 min、30 min、60 min后分别测定肺动脉压、平均气道压力；肺静脉血氧分压（ PvO2），再灌注结束后取材测肺组织含水量（LW）。
根据检测指标下列参数:
灌注后肺血管阻力(PVR)=平均肺动脉压/肺血流
肺通气阻力(LR)=平均气道压力/潮气量
肺含水量(LW)=(Wr-Wd)/Wr×100%
1.5 统计学处理 应用SPSS 10.0统计软件进行t检验,两组各时间点测得值以均数±标准差(±s)表示,以P<0.05为差别显著。
2 结果
2.1 肺血管阻力(PVR) 实验组复灌10 min、30min、60 min PVR均低于对照组，两组相对应时间点PVR有显著性差异(P＜0.05)。见表1。
2.2 肺静脉血氧分压（PvO2） 实验组复灌10min、30 min、60 min PvO2均高于对照组，两组相对应时间点PvO2有显著性差异(P＜0.05)，见表1。
2.3 肺通气阻力（LR） 随着复灌时间的延长，两组不同时间点肺通气阻力无明显差异，组间比较亦无差异。见表1。
2.4 肺含水量(LW) 两组复灌60 min后肺组织含水量（LW）差异没有显著性(P>0.05)。 见表1。
表1 两组再灌注后各项检测指标（略）
注：*与对照组相比，P＜0.05
3 讨论
在离体肺的获取、保存、移植甚至移植以后，由于各种损伤因素的介入导致了肺损伤的发生。肺损伤的本质是炎性细胞激活后产生的炎性反应。炎性细胞包括：各种白细胞、血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞、血小板和内皮细胞。炎性细胞活化后的共同性的变化为：①细胞变形，如内皮细胞变圆；②分泌炎性因子、溶酶体酶［如弹性蛋白酶（NE）、组织蛋白酶］或凝血因子，形态上伴有脱颗粒的变化；③细胞表面表达黏附分子或原有的无黏附活性的黏附分子变得有黏附活性。导致血浆中炎性介质、促炎介质增多，如活化的补体、白三烯（leukotrienes,LTs）、血栓素A2(thromboxaneA2,TXA2),肿瘤坏死因子（TNF-α）,白介素（IL）-1,IL-6,IL-8等以不同的先后次序，不同的幅度升高，它们与炎性细胞相互作用，互为因果，致使炎性反应爆发［2］。其中中性粒细胞与内皮细胞黏附，通过内皮细胞间隙游走至肺组织间隙，通过下列因素引起肺损伤［3］:①蛋白酶,如组织蛋白酶、NE和胶原蛋白酶等;②氧自由基;③花生四烯酸代谢产物,如前列环素(PGI2)、TXA2和LTs等。
环磷酰胺有免疫抑制作用,可抑制白细胞活性。可选择性地抑制Ｂ淋巴细胞,大剂量时还能抑制Ｔ淋巴细胞,从而阻断体液免疫和细胞免疫反应［4］。
同时环磷酰胺又是抗肿瘤药物，属于细胞周期非特异性化疗药物,具有细胞毒性，对增殖周期中各期细胞均有杀灭作用［5］,有抑制骨髓的作用,使白细胞下降,对粒细胞的影响更为明显。
本实验结果显示，获取离体肺前给与环磷酰胺干预，产生了较好的离体肺保护效果，可能的机制是环磷酰胺作用于炎性细胞，在兔离体肺获取前使兔的体液免疫以及细胞免疫受到一定程度的抑制，减轻离体肺保护过程中的炎性反应，达到肺保护的目的。
本研究不足之处：①实验前没有通过检测白细胞计数以及炎性因子水平，评估环磷酰胺的剂量、以及达到的效果。②检测指标较少，没有病方面的指标。③可以在本研究的基础上继续一些移植方面的研究。
【】
［1］ Kaiser LR,Cooper JD. The current status of lung transplantation ［J］. Adv Surg, 1992, 25(1):259-307
［2］ 吴其夏，余应年，卢建.新编病理生理学［M］.北京：协和医科大学出版社，1999,ISBN7-81072-012-0/R.012.
［3］ Wan S, LeClere JL, Vincent JL. Iflammatory response to cardiopulmonary bypass: mechanisms involved and possible therapeutic strategies［J］. Chest， 1997， 112（3）：676-692.
［4］ 叶雨文，卞如濂. 基础药理学［M］. 杭州：浙江人民出版社, 1999,306.
［5］ Del Zoppo GJ, Becker KJ, Hallenbeck JM. Inflammation after stroke［J］. Arch Neurol, 2001, 58(4):669-672.
