聚乙二醇牛血红蛋白偶联物对血清炎性因子的影响
作者：赵明霞，龙村，贺学英，管博，王蕊
【摘要】 目的 探讨在体外循环（extracorporeal circulation，ECC）预充液中加入聚乙二醇牛血红蛋白偶联物（PEG-bHb）对兔血清炎性因子的影响。方法 24只成年健康大耳白兔，通过股动脉、颈静脉插管建立体外循环通路，转流1 h。随机分成三组，对照组（n＝8），以晶/胶体液作为ECC预充液；实验组1（n＝8），在预充液中加入PEG-bHb，PEG-bHb占总容量（兔循环血量＋预充量）的5%；实验组2（n＝8），预充液中加入PEG-bHb，占总容量（兔循环血量＋预充量）的15%，ECC开始时放出自体血（放血量占兔循环血量的20%），ECC结束后将自体血回输。每组监测ECC前、中和ECC后的血气参数，用ELISA法测定各时间点血清白介素－6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、C反应蛋白（CRP）浓度。结果 三组在ECC后各时间点的炎性因子无显著差异，但实验组2在ECC后各时间点的炎性指标较对照组相比有下降的趋势。结论 血液代用品PEG－bHb单纯用于预充对兔ECC后炎性反应无影响，用PEG-bHb置换自体血有可能减轻兔ECC后炎性反应。
【关键词】 炎性因子；血液代用品；体外循环；PEG-bHb
Abstract: OBJECTIVE To investigate the effect of PEG-conjugated bovine hemoglobin (PEG-bHb) on inflammatory factors when added directly to extracorporeal circulation（ECC） prime in anaesthetized rabbit. METHODS 24 anaesthetized rabbits (2.59±0.19)kg, connected to ECC by jugular venous and femoral arterial cannulation and bypass for 1 hour, were randomly divided into 3 groups. In control group(n=8), a crystalloid/colloid solution was used as prime solution. In experimental group 1(n=8), PEG-bHb (5% total volume) was added to the pump prime of bypass. Total volume is the sum of circulation volume and prime volume. In experimental group 2(n=8), PEG-bHb (15% total volume) was used in the pump prime with previous blood harvesting(20% circulation volume) before ECC. Blood gas were monitored throughout the procedure. The inflammatory factors (IL-6,TNF-α,CRP) were measured using ELISA.RESULTS There were no significant difference of IL-6,TNF-α and CRP between three groups. But in experimental group 2, the inflammatory factors were less than those in control group, but not significantly.CONCLUSION PEG-bHb added to the prime of a rabbit ECC circuit does not independently affect inflammatory response. PEG-bHb on the prime with previous blood harvesting before ECC may improve inflammatory response.
Key words： Inflammatory factor; Blood substitute; Extracorporeal circulation; PEG-bHb
聚乙二醇牛血红蛋白偶联物（polyethylene glycol conjugated bovine hemoglobin，PEG-bHb）是我国研究开发的一种血红蛋白类血液代用品，研究表明，PEG-bHb具有良好的携带、释放氧的能力，同时具有大分子物质的扩容效应，因此，PEG-bHb在提升血压、恢复微循环血流量的同时，可以改善组织的氧供(资料由北京凯正生物工程有限责任公司提供)。
本实验将PEG-bHb用于兔体外循环（extracorporeal circulation，ECC）预充，研究其对炎性因子的影响，为进一步应用于临床提供可靠理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 成年健康大耳白兔24只，雌雄不限，体重2.3～2.8（2.59±0.19）kg，由军事医学院动物中心提供，符合清洁级实验动物标准。动物饲养与实验均符合我国卫生部《医学实验动物管理实施细则》（1998年）的要求。
24只动物随机分为三组。对照组（组Ⅰ,n=8），以晶/胶体液（血定安50 ml，乳酸林格液）作为ECC预充液；实验组1（组Ⅱ,n＝8），在预充液中加入PEG-bHb，占总容量（兔循环血量＋预充量）的5%；实验组2（组Ⅲ,n＝8），预充液中加入PEG-bHb，占总容量（兔循环血量＋预充量）的15%，ECC开始时放出自体血（放血量占兔循环血量的20%），ECC结束后将自体血回输（如图1）。
图1 实验流程（略）
1.2 动物准备与实验操作 动物清醒状态下称重，建立耳缘静脉通路，3%戊巴比妥钠30 mg/kg缓慢静脉推注麻醉。耳中动脉穿刺监测系统动脉压，肝素化后，颈静脉插管（14G动脉穿刺针）连接ECC静脉引流管，股动脉插管（18G动脉穿刺针）连接灌注管，建立常温ECC通路，泵流量维持（38±11）ml/min。ECC中应用中空纤维膜式氧合器（动物实验膜肺 西京医疗用品有限公司提供），总预充量（氧合器，循环管道）约为80 ml。ECC总时间为1 h，拔出动静脉插管，结扎颈静脉和股动脉，给予鱼精蛋白（1∶1）中和肝素，缝合切口。动物清醒继续饲养7天后处死。
1.3 指标检测 分别在ECC前和ECC后24 h检测动脉血气，在ECC中15 min、50 min检测动、静脉血气；分别在ECC前、ECC后4 h、8 h、24 h、48 h测血清IL-6、TNF-α，在ECC前、ECC后24 h、48 h、7d测血清C反应蛋白(CRP)。
1.4 实验数据统计学分析 实验数据均以均数±标准差（±s）表示。采用SPSS 11.0统计分析软件对组间数据进行t检验，P ＜0.05为差异有显著性。
2 结果
比较各组实验兔动、静脉血气指标（见表1），结果显示：
2.1 三组pH、PCO2在ECC前、ECC 15 min、50 min及ECC后24 h无显著差异。
2.2 在ECC中，对照组和实验组均给予100%氧气，各组转中动脉PO2均较高，在ECC 50 min时，组Ⅱ和组Ⅲ静脉PO2较低，组Ⅲ与组Ⅰ相比有显著差异（P<0.05）。
2.3 ECC中血红蛋白(Hb)组Ⅲ低于组Ⅰ和组Ⅱ（P<0.05），ECC结束后组Ⅲ 将自体血液回输，因此转后24 h水平组Ⅲ 与组Ⅰ和组Ⅱ相比，无显著性差异（P>0.05）。
各组炎性因子结果比较（见表2和图2），结果显示：
2.4 在ECC后各时间点中，IL-6和TNF-α三组相比无显著差异，（P>0.05）。
2.5 组Ⅰ中CRP在ECC前的测定值明显低于另外两组，调整基线后用协方差分析方法比较，三组ECC后各时间点CRP值无显著差异，（P>0.05）；但从图2可以看出组Ⅲ中ECC后各时间点CRP值均低。
图2 各组CRP结果比较（略）
表1 各组pH、PCO2、PO2、Hb、P50 比较（略）
注： *与组Ⅰ比较，P<0.05；#与组Ⅱ比较，P<0.05
表2 各组IL-6、TNF-α结果比较（略）
3 讨论
PEG-bHb是一种分离纯化的牛血红蛋白，用琥珀酰亚胺聚乙二醇修饰，配成含血红蛋白55～60g/L、氯化钠150 mmol/L、碳酸氢钠5 mmol/L、磷酸氢二钠4 mmol/L、磷酸二氢钠1 mmol/L的溶液。目前，在成人ECC心血管手术中多采用晶体加胶体液预充的方法，但晶体液和胶体液均无携带氧和二氧化碳的功能，两者并不是理想的预充液。本实验将PEG-bHb用于兔ECC预充观察了其对炎性因子的影响。
ECC过程中肝素化的血液与非内皮细胞表面接触启动了机体的炎性反应［1-4］，血浆蛋白系统、中性粒细胞、单核细胞、内皮细胞和部分血小板均参与了此反应。主要的血细胞成分活化后释放血管活性物质及细胞毒物质；产生细胞因子及炎性因子；表达补体细胞受体，与特殊的细胞信号物质和其他细胞相互反应，在循环中产生血管活性和细胞毒性物质［5］，导致毛细血管通透性增高，血管张力改变，体液平衡及机体主要器官功能紊乱，严重时甚至造成多器官功能障碍。由此可以看出，假如自体血液不与非内皮表面接触，血细胞成分未被活化，则机体的炎性反应会明显减轻，同时，自体血也得到了保护。本实验所测定的IL－6、TNF-α和CRP是参与ECC炎性反应的三种主要促炎性因子［6-8］。
本实验结果显示，三组的IL-6、TNF-α和CRP均无显著差异，由此可以说明PEG-bHb作为预充液不会加重ECC炎性反应；另外，组Ⅲ在ECC后各时间点的炎性指标较对照组相比有下降的趋势，尤其是CRP的浓度测定，转后各时间点的测定值均较其他两组低，可能由于各组样本量较少使统计学差异不显著，但基于血液保护的理论，由此可以推测，用PEG-bHb置换自体血将对减轻机体炎性反应起到一定作用。
本实验的各项血气指标显示，组Ⅲ由于转前放血的原因，转中Hb与其它两组相比有显著差异，但术后将自体血液回输后Hb即恢复；ECC 50 min时，组Ⅱ和组Ⅲ的PvO2均较低，且组Ⅲ与对照组相比有显著差异，提示组织利用氧增多，其原因可能是PEG-bHb能够改善微循环使微循环血流增加［10-11］，随之组织氧利用增加，由此推测PEG-bHb在一定程度上改善了各脏器的缺氧。在ECC中组Ⅱ和组Ⅲ的P 50值较高，且组Ⅱ在ECC 50 min时，与对照组相比有显著差异，提示向组织释放O2量增加，但是，PEG-bHb本身与红细胞内的Hb相比氧离曲线左移，此结果说明，PEG-bHb有较高的氧容量、与氧气的亲和力类似于全血，因此其向组织释放氧气较非携氧剂明显增多［11-12］。
本研究表明，PEG-bHb可安全用于兔体ECC预充，对兔ECC后炎性因子无影响，同时还可以增加微循环血流，增加组织氧供；虽然用占总容量（兔循环血量＋预充量）15％的PEG-bHb置换自体血，炎性因子有下降的趋势，但其是否真正达到血液保护的目的需要进一步研究和证实。
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