黄芪激活ERK1/2信号转导通路抗心肌细胞再灌注损伤作用

               作者：宋光，何蕾,王彬,江朝光

【摘要】  目的 研究黄芪注射液调节ERK1/2信号转导通路抗培养乳鼠心肌细胞再灌注损伤的作用。方法 采用培养的SD乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型，实验分为五组：A组为正常对照组，B、C、D、E组均为缺氧／复氧组，其中各组培养液组成为：B组缺氧液，C组缺氧液加黄芪，D组缺氧液加PD98059，E组缺氧液加黄芪和PD98059。缺氧4h，复氧2 h。比较缺氧/复氧前后培养液中心肌酶含量，并进行心肌细胞外信号调节激酶(ERK)蛋白表达检测。结果 缺氧/复氧后对各组细胞培养液中心肌酶含量进行比较，结果显示各缺氧组与正常对照组比较，心肌谷草转氨酶(GOT)，乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶(CK)均有升高（P＜0.05）。黄芪缺氧组与缺氧对照组比较，GOT升高减轻（P＜0.05）。ERK抑制剂PD98059对黄芪的保护作用有一定削弱，但没有统计学意义。黄芪可使缺氧/复氧引起的心肌细胞ERK表达增加， PD98059对黄芪引起的ERK表达增加没有明显抑制作用。结论 黄芪能够减轻缺血再灌注损伤，其机制涉及了ERK1/2信号途径。

【关键词】  信号转导；再灌注损伤；心肌保护；细胞低氧

    Abstract: OBJECTIVE   To evaluate the protective effect of astragalus injection through activation of ERK1/2 pathway in cultured cardiac myocytes. METHODS  Studies were conducted on cultured cells. Rat ventricular myocytes were subjected to hypoxia 4h and reoxygenation 2h. Astragalus injection was applied to cells during ischaemia/reoxygenation, myocardial enzyme was determined and ERK1/2 expression was detected by Western blot after 120 minutes of reperfusion. RESULTS  In cardiac myocytes, incubation with astragalus during ischaemia/reoxygenation attenuated the extent of cell damage. Protective effect of astragalus injection was decreased by PD98059, an inhibitor of ERK1/2 activation,but had no statistical significants. Astragalus activated ERK1/2 in ischaemia/reoxygenation myocytes. CONCLUSION  This studiy shows that astraglus attenuates cardiac myocytes injury during reperfusion and the mechanism involves ERK1/2 activation.

    Key words：  Astragalus; Cardioprotection; ERK pathway; Cell hypoxia.

    黄芪这种古老的中药具有明确的抗再灌注损伤作用，其机制可能与扩张冠状动脉，改善心肌血供等多方面有关。但黄芪是否通过参与某些信号途径，从而调动了正向的保护机制少有研究。报道促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)在体内体外的心肌组织缺血再灌注损伤实验中都能激活。本文旨在研究黄芪抗再灌注损伤作用与MAPK家族中心肌细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)1/2信号通路活化的关系，探讨黄芪的心肌保护作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  原代心肌细胞培养  取材自同窝出生1～3 日龄Sprague Dawley大鼠（由解放军总实验动物中心提供）心室组织，原代心肌细胞接种于培养瓶内，纱巾法培养。37℃，5%CO2饱和湿度培养箱（REVCO公司，美国）内培养24h使细胞贴壁生长。经鉴定90％以上为心肌细胞，90％以上为活细胞即可用于实验［1］。

    1.2  缺氧/复氧心肌细胞模型制备  原代培养心肌细胞于实验前更换含1%胎牛血清DMEM培养液培养24h。缺氧实验开始时更换缺氧缓冲液。缺氧缓冲液（NaCl 137 mM,KCl 12 mM,MgCl2 0.49 mM,CaCl2 0.9 mM,HEPES 4 mM,deoxyglucose10 mM,sodium lactate 20 mM,pH 6.2）［2］为高钾低pH溶液，用以模拟心脏细胞暴露于无氧条件。其后将细胞置于配气（95%N2+5%CO2，北京普莱特斯公司）饱和的容器中，放入孵箱，37℃培养4 h。4 h后恢复有氧环境，倾去缺氧缓冲液，换正常10％血清极限必需培养基(DMEM)后将细胞置于5%CO2孵箱中，于复氧条件下继续培养2 h，造成心肌细胞缺氧复氧损伤。

    1.3  实验分组及实验方法  培养的乳鼠心肌细胞随机分为5组。A组正常对照组，不加入黄芪，也不进行缺氧复氧处理。B组，C组，D组，E组均为缺氧／复氧组，其中各组培养液组成为：B组缺氧液，C组缺氧液加黄芪，D组缺氧液加ERK抑制剂PD98059（Promega公司，美国），E组缺氧液加黄芪和PD98059，黄芪终浓度为200μl黄芪/ml培养液，PD98059终浓度5 μΜ［2］。实验开始时A实验组更换10%胎牛血清DMEM培养液入培养箱培养6 h。缺氧／复氧各组更换相应缺氧培养液，缺氧培养4h，随后更换相应复氧培养液培养2 h。实验结束时取各组培养液0.5 ml在全自动生化分析仪上测定心肌酶含量，并将各组细胞提取蛋白进行检测。

    1.4   Western Blot免疫印迹检测ERK蛋白表达  实验结束后收集心肌细胞并裂解，采用Bradford考马斯亮蓝法，通过测量595 nm处的吸光度值，进行蛋白质定量。随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，积层胶浓度5%，分离胶浓度10%，电泳在Tris-甘氨酸缓冲液中进行，所用电压为： 积层胶 120 V，分离胶140 V。电泳结束后硝酸纤维素膜电转移2 h， 电流0.65mA/cm2。转膜完成后10％的脱脂奶粉37℃封闭硝酸纤维素膜1h，加入1∶300小鼠抗ERK抗体（Santa Cruz，美国）孵育，4℃过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后加入1∶1000HRP标记羊抗小鼠二抗（中杉金桥生物技术公司，北京），37℃孵育1 h。PBS漂洗后发光试剂显色，曝光，冲洗，扫描成像。图像经凝胶图像分析系统分析。

    1.5  统计方法  采用SAS软件v8.2版本进行统计学分析。数据用均数±标准差(±s )表示，组间两两比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  缺氧/复氧心肌细胞培养液中心肌酶的变化  缺氧/复氧后对各组细胞培养液中心肌酶含量进行比较，结果显示各缺氧组与正常对照组比较，心肌谷草转氨酶(GOT)，乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶(CK)均有升高，P＜0.05。而黄芪缺氧组与缺氧对照组比较，GOT升高减轻，P＜0.05；LDH和CK升高也减轻，但没有统计学意义。说明加入黄芪后心肌细胞的再灌注损伤有所减轻。其余组两两之间比较没有明显差异。ERK抑制剂PD98059对黄芪的保护作用有一定削弱，但没有统计学意义，见表1。表1  缺氧/复氧心肌细胞培养液中心肌酶的变化注：*与B组比较，P＜0.05

     2.2  缺氧/复氧心肌细胞ERK蛋白表达的变化  正常组心肌细胞有一定量ERK表达（A组），在缺氧/复氧后心肌细胞ERK表达增加（B组），黄芪加缺氧的双重刺激使ERK表达增加更明显（C组），加入ERK抑制剂PD98059后其表达明显减少（D组），而黄芪＋PD98059组ERK表达无明显减少（E组）。见图1。图1  缺氧/复氧心肌细胞ERK蛋白表达的变化注：1：A组；2：B组；3：C组；4：D组；5：E组

    3  讨  论

    MAPK是一类参与细胞内信号传导的蛋白质家族。是细胞外信号引起细胞核反应的共同通路。缺血、缺氧、细胞因子等各种刺激都可引起Raf-MAPK的磷酸化连锁反应而最终激活［3］。活化的MAPK转位入核后引起转录因子磷酸化，提高应激蛋白基因转录水平，合成相关蛋白质，最后发挥心肌保护作用。在哺乳动物中MAPK包括ERK、应激激活的蛋白激酶(SAPK)和P38MAPK。参与减轻缺血再灌注损伤中的细胞凋亡有几种途径，即p42/44（ERK1/2）MAPK［4］途径、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）途径和STAT途径［5-6］。用新生大鼠构建缺血预适应模型，观察到MAPK在缺血、再灌、致死性的缺血3个环节中均被激活，并且很快磷酸化ERK-l，ERK-2，心肌损害作用明显低于对照组［7-8］。

    MAPK在体内体外的心肌组织缺血再灌注损伤实验中都能激活。Talmor等人2000年的研究表明体外循环过程中p38－MAPK，JNK，ERK1/2在冠脉搭桥手术中没有变化。但ERK1/2 和 p38-MAPK磷酸化及活性增加，缺血后增加约2倍，再灌注后ERK1/2 和 p38-MAPK分别增加了8倍和4倍［9］。

    多项研究表明细胞凋亡参与心肌缺血再灌注损伤的病理过程，并起重要作用。针对再灌注时相抗细胞凋亡机制的，是减轻再灌注引起细胞死亡的潜在方法。通过给予药物，上调某些促生存信号途径（pro-survival kinase cascades），被Hausenloy等人称为再灌注损伤救援激酶途径（reperfusion injury salvage kinase, RISK）［10］。其中包括蛋白质激酶磷脂酰肌醇3激酶(PI3K) -AKT和p42/44（ERK1/2）两种途径。研究发现在模拟缺血、缺氧而剥夺血清、氧气的培养环境中，加入黄芪注射液可以减轻体外培养的新生大鼠心肌细胞凋亡率。提示黄芪可能通过影响细胞内信号转导通路而调控心肌细胞的凋亡。

    周云枫等人的研究表明黄芪多糖能有效增加PI3K 的水平，通过调节信号转导，治疗2型糖尿病［11］。黄芪注射液中含有少量的黄芪多糖，黄芪注射液是否有胰岛素样作用，黄芪能否成为中药中的“胰岛素”？能否像胰岛素一样通过与其受体结合，激活PI3K信号途径，实现心肌保护的作用，也有待进一步研究。报道，对葛根素的研究发现其中的异黄酮能显著增加过氧化物酶增殖物活化受体-α（PPAR-α）基因表达［12］，而PPAR-α活化抑制细胞核因子NF-κB激活及多种促炎细胞因子释放，抑制心肌嗜中性粒细胞积聚及心肌MMP-9表达，从而保护缺血心肌、防止梗死范围扩大［13］。那么黄芪中的黄酮是否有异曲同工的效果不得而知。本研究也发现黄芪的确参与了信号途径。ERK抑制剂PD98059可以减弱缺氧诱导的ERK表达，但不能抑制黄芪诱导的表达，说明黄芪还可能通过其它途径诱导其表达。黄芪注射液是多种成份的混合物，是其中的一种成分还是几种成分在起着信号调节的作用，是如何作用，还需要更多的研究。

【文献】
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