缺血再灌注心脑细胞凋亡与线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道

【关键词】  线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道；细胞凋亡；缺血再灌注；心肌保护

    细胞凋亡或称程序性细胞死亡，是受基因调控的主动性细胞死亡形式。细胞凋亡是导致缺血再灌注损伤的重要因素，抑制再灌注时诱发的细胞凋亡，即可减轻心肌缺血再灌注损伤，细胞凋亡在缺血再灌注损伤中有重要的病理生理意义。自从Inoue 1991年在大鼠肝脏细胞中发现线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive Potassium channel，Mito-KATP )以来，Mito-KATP 通道又成为一个新的心脑保护切入点，它是目前公认的心脑保护多条传导通路的终末效应器。Mito-KATP 激动剂预处理限制心脑细胞凋亡已在不同动物种属的活体、离体及心脑细胞的实验研究中得到证实，线粒体在心脑细胞凋亡中起中心作用。

    1  心肌保护和线粒体途径

    1.1  Mito-KATP介导的抑制心肌细胞凋亡  Mito-KATP通道是包括一个55 KDa内向K+ 通道和一个63KDa磺脲类受体的异源多聚体，是一组将细胞膜电活动与细胞代谢联系在一起的重要通道，在调节细胞功能中起关键作用［1］。当线粒体基质ATP不足时，此通道开放，线粒体产生内向K+电流，线粒体基质体积短时增大，呼吸链活性显著增强，开放Mito-KATP通道对缺血再灌注心脑起保护作用的机制目前尚不完全清楚。

    IPC作为一种内源性保护机制，可减轻缺血再灌注导致的心肌细胞坏死。近年研究显示，IPC也可抑制缺血再灌注时的细胞凋亡，IPC对缺血再灌注损伤的保护作用与其减少细胞凋亡有关。此外，还发现IPC可影响凋亡相关基因的表达［2］。现认为IPC的心脏保护机制部分或全部由Mito-KATP 介导，Mito-KATP是此过程的最后效应分子，其保护作用是通过磷酸化后的Akt从细胞质易位到线粒体而起作用的［3］。Ichinose［4］等通过体外培养乳鼠心肌细胞发现，Mito-KATP 通道开放后可以显著降低氧应激诱发的心肌细胞凋亡的发生率，培养的乳鼠心肌细胞经Mito-KATP 通道开放剂二氮嗪干预后，氧化应激诱发的心肌细胞的凋亡明显减少，线粒体膜电位丢失减小。在缺血再灌注的早期有大量的氧自由基的产生，开放Mito-KATP可以增强细胞对氧应激的抵抗力，稳定线粒体跨膜电位(Δψm)，减少线粒体内膜的通透性转换孔（MPTP）开放及细胞凋亡的蛋白质释放，减少心肌细胞的凋亡。

    1.2  mito-KATP抗调亡的机制   目前已知Mito-KATP是一个经典的心肌保护效应，但mito-KATP的开放对缺血再灌注心肌细胞调亡的保护作用机制尚不清楚，可能与以下机制有关。

    1.2.1  防止Δψm的耗散  Δψm对于维持线粒体的完整性和功能起着重要作用。跨膜电位的形成主要依赖于内膜上的传递链中的复合体Ⅰ，后者实际上是个质子泵，在电子传递过程中将质子打出内膜外，从而形成内膜外的高浓度质子电位势能和高pH的化学势能，这就是线粒体跨膜电位的基础。mito-KATP通道开放剂作用于通道后引起了胞浆钾离子的内流，呈浓度依耐性预防Δψm的耗散。近年来陆续有报道说明缺氧复氧后，Δψm严重降低，而一旦Δψm耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程，而且Δψm在凋亡过程中很早就降低了，早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。线粒体解联的呼吸链会产生大量活性氧，氧化线粒体内膜上的心磷脂。实验证明，用解偶联剂mClCCP会导致心肌细胞凋亡，而如果能稳定Δψm就能避免氧化还原失衡、磷酯酰丝氨酸的暴露与蛋白酶和核酸酶的激活，防止细胞凋亡。

    1.2.2  抑制线粒体内膜通透性转变  细胞凋亡过程中由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的MPTP，导致线粒体内膜的通透性转变。线粒体内膜通透性转变是细胞凋亡的必要条件，MPTP打开后导致线粒体许多功能的致命性变化从而启动了凋亡途径［5］。MPTP的作用有自放大的效应, 可诱导ΔΨm耗散。MPTP开放后，释放细胞色素c和凋亡诱导因子，通过级联反应激活了一系列细胞内的水解酶，最终激活细胞的“杀手”(caspase-3等)，启动了凋亡程序，引起细胞凋亡6-7］。从MPTP开放到caspase的激活之间存在着一条正反馈的通路，使得细胞的凋亡途径变得不可逆。二氮嗪开放Mito-KATP通道后使缺氧条件下的细胞Δψm去极化，呈浓度依耐性的减少H2O2导致的Δψm的耗散，最大效应浓度为100μmol/L，从而抑制复氧时线粒体内膜通透性转变。因此，阻断MPTP的打开至凋亡酶的激活的通路，就能预防心肌细胞的凋亡。MPTP抑制剂CSA、BA可抑制H2O2引起的Δψm的耗散，而5-HD不能阻断二者的作用，提示Mito-KATP通道是MPTP的上游通路［8］。

    1.2.3  调节氧自由基(ROS) 的产生及防止细胞色素C 渗漏  线粒体呼吸链是缺血再灌注过程中自由基的一个重要来源，氧自由基一经生成，在体内发生连锁反应，生成多种具有高活性的氧还原中间产物，统称为活性氧簇。Mito-KATP的激活使ROS生成增多，而少量的ROS对于维持线粒体膜电位、阻止细胞凋亡是很重要的，且此少量的ROS还可能抑制缺氧导致的后续ROS大量生成。ROS激活PKC，活化的PKC易位到线粒体内，降低Δψm的耗散，使通透性限制酶磷酸化，降低线粒体的通透性［9］，阻滞Ca2+内流增加，阻止了基质中钙的超载［10］，同时下调fas基因的表达，减少Bax异位 ，增加Bcl-2蛋白水平［11］。高表达的Bcl-2能防止ΔΨm的耗散，从而导致对苍术苷、原卟啉IX与mClCCP的不敏感与凋亡启始因子(AIF)释放的抑制；反之，高表达Bax则导致ΔΨm的耗散。Mito-KATP通道的抗调亡作用机制实际是使促调亡蛋白和抗调亡蛋白达到平衡［12］。

    持续缺氧会导致ROS持续积累，过高的ROS 持续积累导致Δψm下降，MPTP开放，细胞色素C、凋亡诱导因子、Ca2+以及膜间隙中的半耽天冬酶原(Procaspase)等凋亡因子被释放到细胞质中。释放到胞质中的细胞色素C与凋亡蛋白水解酶激活因子(Apoptosis protease activatingfactors, Apaf-1)及caspase复合物结合，进而激活caspase-9和caspase-3，后者进一步激活半耽天冬酶激活的DNA酶( Caspaseactivated DNase, CAD)，最终导致染色体凝集、DNA断裂而发生凋亡。在过氧化氢（H2O2）诱发的心肌细胞氧化应激的模型上预先给予Mito-KATP通道开放剂二氮嗪再诱发氧化应激，则细胞核出现TUNEL阳性的频率降低，细胞色素C的释放被抑制，免疫荧光染色caspase-3、caspase-9发现其活性降低并可延迟其活化［13］。caspase抑制剂也可减少细胞调亡，但不减少细胞色素C 释放， caspase可能是细胞色素C的下游通路。因此，Mito-KATP通道开放可减少ROS过度增加引起的细胞凋亡。

    1.2.4  降低钙超载  缺血再灌注期间，缺氧所致能量产生的不足，可使心肌细胞线粒体膜难以维持正常的结构和功能，对Ca2+的通透性升高，导致Ca2+内流，从而激活细胞内磷脂酶，引起膜磷脂的水解，从而加重了膜结构的破坏，使膜通透性进一步增加，而心肌细胞膜和肌浆网通透性的改变可加重钙内流，如此形成恶性循环。开放主动脉后的再灌注期间，大量产生的氧自由基及细胞内钙超载，均可进一步激活磷脂酶，使细胞膜和细胞器膜出现再灌注损伤，可导致包括细胞膜破裂、细胞死亡在内的严重损伤。Ca2+超载还可作用于PT孔并使之开放，加重细胞色素C释放，从而促进细胞变成泡状凋亡小体。

    Crestanello［14］等发现开放Mito-KATP通道还可预防心肌细胞线粒体钙超载。开放Mito-KATP通道可以保护线粒体的结构与功能，加速呼吸链的电子传递及氧化磷酸化的形成，利于ATP生成。二氮嗪激活心肌细胞膜上mito-KATP后，K＋外流，心肌细胞膜超极化降低动作电位第三相，从而缩短动作电位时程，Ca2+内流减少，减轻心肌细胞机械活动，降低Ca2+超载和能量消耗，从而实现IPC对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护 ［15-16］。可见，在心肌缺血时，如果保持Mito-KATP的开放就能够增加ATP产量，减轻线粒体的结构损伤，阻止钙超载，并提高再灌注时受损心肌的功能恢复。

    2  Mito-KATP通道与神经细胞凋亡

    脑内Mito-KATP通道的含量大约是心脏的7倍。Zhan等［17］发现缺血预处理能减少缺血所致的线粒体细胞色素C的释放，从而抑制缺血后的神经细胞凋亡。与心肌细胞的凋亡过程相似，神经元的凋亡通路也经过线粒体膜电位的耗散而导致MPTP开放，MPTP开放又进一步导致了膜电位 的耗散［18］。MPTP开放后线粒体和胞浆的一些物质可以自由交换，从而使线粒体外膜破裂， AIF漏出，触发了凋亡的级联反应。

    一般认为Mito-KATP通道开放抑制缺血再灌注导致的神经元凋亡的机制与心肌细胞相似，与ROS 的产生、细胞色素C 渗漏及钙超载等有关。但中枢神经系统Mito-KATP通道开放还可减少谷氨酸的释放。谷氨酸是中枢神经系统重要的神经递质,谷氨酸通过激活NMDA受体，使Ca2+流入细胞质增加，改变脑代谢，促进脑发育。但谷氨酸增多则会引起神经细胞兴奋性中毒和Ca2+超载，从而导致细胞死亡。缺血时，ATP耗竭诱导谷氨酸转运体将其转运到细胞外， H2O2增加细胞外谷氨酸。KATP激活使突触后谷氨酸敏感性神经元超极化，阻滞因缺血导致的细胞外谷氨酸过度释放及其包括离子型谷氨酸受体在内的多种谷氨酸受体过度激活诱导的去极化效应，从而阻断突触后兴奋毒性效应。KATP激活降低细胞外谷氨酸的机制还不清楚,可能是引起细胞内K+外流，突触前膜电位超极化，对抗电压依赖性钙通道，阻止细胞外Ca2+ 内流，降低细胞内Ca2+浓度，从而阻滞缺血缺氧诱发的突触前谷氨酸过度释放［19］。

    3  小结

    缺血再灌注后心脑细胞凋亡是当前研究的热点，但其机制尚未完全清楚，有些问题尚需要进一步深入研究。如果能够阻止凋亡的，就有可能减轻心脑缺血再灌注损伤的程度。深入研究凋亡发生、发展的机制，有可能为防治心脑缺血再灌注损伤开拓一个新的思路和方向。Mito-KATP的开放阻断了凋亡通路中的上游路径：线粒体膜电位的耗散、细胞色素C的易位等。进一步阐明Mito-KATP的分子生物学与药特性及在细胞凋亡中的作用，有助于深入了解细胞凋亡的机制与对疾病的防治。深入了解其与心脑细胞凋亡的关系将加深人们对这一通道的认识，并有望为心脑细胞凋亡相关疾病的预防和治疗提供新的靶标。因此在凋亡增强的缺血损伤心脑疾病中，选择以Mito-KATP作为治疗靶位，可以产生很好的保护作用，为抗心脑缺血治疗开辟了一条新途径。

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  ［1］ Bajgar R,Seetharaman S,Kowahowski AJ,et al. Identification and properties of a novel intracellular (mitochondria1) ATP-sensitive potassium channel in brain ［J］. J Biol Chem,2001, 276(36): 33369-33374.

［2］ 孙忠东, 池一凡, 杨铁南, 等. 心肌缺血预处理对未成熟心肌细胞凋亡的影响 ［J］. 体外循环杂志, 2004, 2(1): 25-27.

［3］ Ahmad N, Wang Y, Haider KH,et al. Cardiac protection by mitoKATP channels is dependent on Akt translocation from cytosol to mitochondria during late preconditioning ［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,290(6):H2402-2408.

［4］ Ichinose M,Yonemochi H,Sato T,et al. diazoxide triggers cardioprotection against apoptosis induced by oxidative stress ［J］. Am J Phsiol Heart Circ phsiol,2003, 284(6): H2235-2241.

［5］ Xu M, Wang Y, Ayub A,et al. Mitochondrial K(ATP) channel activation reduces anoxic injury by restoring mitochondrial membrane potential ［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2001,281(3): H1295-1303.

［6］ Viswanath V，Wu Y, Boonplueang R,et al. Caspase-9 Activation results in downstream caspase-8 activation and bid cleavage in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-Induced parkinson's disease ［J］. J Neurosci, 2001, 21(24): 9519-9528.

［7］ Yang JC, Cortopassi GA. Induction of the mitochondrial permeability transition causes release of the apoptogenic factor cytochrome C ［J］. Free Radic BiolMed,1998,24(4):624-631.

［8］ Teshima Y, Akao M, li RA,et al. Mitochondrial ATP-Sensitive Potassium Channel Activation Protects Cerebellar Granule Neurons From Apoptosis Induced by Oxidative ［J］. Stroke,2003,34(7): 1796-1802.

［9］ Juhaszova M，Zorov DB, Kim SH,et al. Glycogen synthase kinase-3beta mediates convergence of protection signaling to inhibit the mitochondrial permeability transition pore ［J］. J Clin Invest,2004,113(11):1535-1549.

［10］ Ishida H,Hirota Y,Genka C,et al. Opening of mitochondrial KATP channels attenuates the ouabain-induced calcium overload in mitochondria ［J］.Circ Res,2001,89(10):856-858.

［11］ Liu D,Lu C,Wan R,et al. Activation of mitochondrial ATP-dependent potassium channels protects neurons against ischemia-induced death by a mechanism involving suppression of Bax translocation and cytochrome c release［J］. J Cereb Blood Flow Metab,2002, 22(4): 431-443.

［12］ Kang PM,Haunstetter A,Aoki H,et al. Morphological and molecular characterization of adult cardiomyocyte apoptosis during hypoxia and reoxygenation ［J］. Circ Res,2000,87(2):118-125.

［13］ Nagata K,Obata K,Odashima M,et al. Nicorandil inhibits oxidative stress-induced apoptosis in cardiac myocytes through activation of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels and a nitrate-like effect ［J］. J Mol Cell Cardiol,2003,35(12):1505-1512.

［14］ Crestanello JA, Doliba NM, Babsky AM,et al. Opening of potassium channels protects mitochondrial function from calcium overload ［J］. J Surg Res,2000, 94(2): 116-123.

［15］ 束斌, 闵苏, 龙村. 缺血预处理对幼兔心肌保护作用及其机制探讨 ［J］.中华麻醉学杂志,2001, 21(6):345-348.

［16］ Rajesh KG,Sasaguri S,Suzuki Ret al. Ischemic preconditioning prevents reperfusion heart injury in cardiac hypertrophy by activation of mitochondrial KATP channels ［J］. Int J Cardiol,2004,96(1): 41-49.

［17］ Zhan RZ, Fujihara H, Baba H,et al. Ischemic preconditioning is capable of inducing mitochondrial tolerance in the rat brain ［J］. Anesthesiology,2002, 97(4):896-901.

［18］ Schinzel A, Takeuchi OHuang, Z,et al. Cyclophilin D is a component of mitochondrial permeability transition and mediates neuronal cell death after focal cerebral ischemia ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(34): 12005-12010.

［19］ Rossi DJ, Oshima T, Attwell D,et al. Glutamate release in severe brain ischaemia is mainly by reversed uptake［J］. Nature,2000,403 (6767):316-321.