深低温停循环下神经生长因子的脑保护作用研究

                作者：祁泉,严 勤,朱德明,蒋祖明,俞晓青,邹文艳

【摘要】  目的 建立一种新的深低温停循环模型，研究深低温停循环(DHCA)对兔大脑皮层、海马组织中神经细胞凋亡情况，探讨DHCA下神经生长因子的脑保护作用。方法 健康新西兰大白兔幼兔(0.5 kg)20只，随机均分为2组：实验组（给予生长因子）和对照组（不给予生长因子）。在DHCA前、后不同时间窗监测血清S100β含量，并采用原位末端标记法(TUNEL染色法)观察和测定脑组织神经细胞凋亡的情况。对照分析两组不同时间窗S100β的变化以及神经细胞凋亡的情况。结果 实验组幼兔在DHCA后神经细胞凋亡数目显著减少(P<0.05)，在DHCA后30 min (T2)、1 h (T3)、3 h (T4)、5 h (T5)、12 h (T6) 5个时间窗血清S100β蛋白含量明显低于对照组(P<0.05)。结论 给予外源性神经生长因子能明显抑制海马以及皮层神经细胞的凋亡，对深低温停循环后的神经细胞有良好的保护作用。

【关键词】  深低温停循环；神经生长因子

    Abstract: OBJECTIVE   To establish a model of deep hypothermie circulatory arrest(DHCA) and  study the neural apoptosis in the hippocampus and cerebral cortex, investigate the protective effects of nerve growth factor(NGF)  during DHCA． METHODS  Twenty healthy baby rabbit(0.5kg)were randomly divided into two groups(10 rabbits per group): study group (preconditioning with NGF) and control group (without NGF). S100β content of blood taken in different window  around DHCA was measured．Neural apoptosis was identified by TUNEL in  hippocampus CA1 region and cerebral cortex of brain．Comparely analysis the change of S100β and the  expression of neural apoptosis in the  hippocampus and cerebral cortex between two group. RESULTS  The number of neural apoptotic cells in study group were decreased significantly during DHCA (P<0.05). Serum S100β levels were significantly difference at post DHCA 30min(T2),1 h(T3),3 h(T4),5h(T5),12h(T6) between two group(P<0.05). CONCLUSION  Exogenous NGF inhabit Neural apoptosis of hippocampus and cerebral cortex and has a protective effect on neuronal injury induced by DHCA.

    Key words：  Deep hypothermie circulatory arrest; Nerve growth factor

    深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest，DHCA)能为心脏及大动脉手术提供一个无血最佳手术视野，但停循环可使全身重要器官尤其是大脑处于缺血、缺氧状态，造成一定程度上的脑组织损伤,如何预防这种损伤是近年来的研究热点。近期许多研究证明神经生长因子(nerve growth factor，NGF)可通过多种机制减少缺血／再灌注神经元的凋亡［1-3］，同时已有研究证明S100β蛋白可作为体外循环(extracorporeal circulation,ECC)心脏手术后评价脑损伤的可信指标［4］。因此本实验拟采用颈总动脉与锁骨下动脉阻断的DHCA模型，以S100β蛋白为标准观察NGF对DHCA下脑组织神经细胞凋亡等损伤的影响，探讨DHCA下的脑保护方法，为后期研究提供理论依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料与分组  实验动物选用健康新西兰大白兔幼兔(上海松江实验动物中心)20只，雌雄各半，体重0.5 kg，随机分为2组，每组10只。实验组：DHCA中给予NGF；对照组：DHCA中不给予NGF。

    1.2  麻醉与监护  每只动物在实验前禁食6 h，速眠新(0.3 ml/kg)诱导后气管插管，呼吸机(Newpont l00)辅助呼吸，呼吸道内正压通气。给予肌松剂维库溴铵(0.1 mg/kg，静脉注射)及硫酸阿托品(0.02 mg/kg，肌肉注射)。耳中动脉内置管，标准第二导联持续心电监测，持续监测直肠温度。

    1.3  建立DHCA模型  冰块袋包埋幼兔，物理降温，肛温降至18℃时停止降温，取动脉血做血气分析后，使体温维持在18℃左右。颈部正中切开皮肤，分离暴露双侧颈总动脉以及锁骨下动脉，用无损伤动脉夹夹闭，造成全脑缺血30 min后松开动脉夹恢复脑血流灌注。用电热吹风机给幼兔复温，将体温恢复到37℃左右，维持正常体温4 h后放置室温下正常饲养。

    1.4  NGF(美国RD公司提供)处理方法  实验组兔在行DHCA前48 h、24 h、12 h、后12 h分别予NGF 0.5 μg/kg耳缘静脉注射，对照组则注射等量生理盐水。

    1.5  标本采集与检测 

    1.5.1  血清S100β蛋白检测  两组均于麻醉诱导前(T1)、DHCA后30 min(T2)、1  h (T3)、3 h (T4)、5 h (T5)、12 h (T6)、24 h (T7)、48 h (T8)和72 h (T9)取耳中动脉血，离心分离血浆于-80℃冰箱保存。采用ElISA法测定血清中S100β蛋白含量(S100β检测试剂盒由美国ADL公司提供)。

    1.5.2  海马以及皮层神经细胞的凋亡检测   两组动物术后3天，在麻醉状态下，经一侧颈总动脉插管灌注37℃生理盐水，冲洗出血管内血液，直到静脉引流出的液体变清。4℃ 4％多聚甲醛(150 m1)行颈总动脉灌注，迅速开颅取脑，取中间块放人相同固定液中继续固定24 h。冠状切面切开兔脑，取出组织块行常规脱水、透明、石蜡包埋并切片，片厚4 μm，将石蜡切片常规脱水，用H-E常规染色以及用原位末端标记法(TUNEL法,TUNEL试剂盒由美国CHEMICON公司生物公司提供)检测凋亡神经细胞。检测程序按试剂盒操作说明进行。TUNEL图片结果采用Axioplan 2 imaging 显微图象分析系统医学图像分析系统进行图像分析。切片在光学显微镜高倍放大视野下随机选取脑皮层及海马各10个视野，计数凋亡细胞数目和总细胞数，凋亡细胞指数(凋亡细胞指数=阳性细胞数／总细胞数×100％)。

    1.6  统计方法  统计学处理采用SPSS 11.5 统计软件包，组间采用t检验，实验数据用(±s)表示，P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  大脑皮质、海马区域神经细胞凋亡的检测  H-E染色示：光镜下对照组大脑海马区域神经细胞呈重度缺血性变化，细胞数目减少，体积缩小，结构模糊或消失 (见图2)。实验组显示海马部位神经元细胞形态正常，未见变性、坏死神经元及小胶质细胞的增生，微血管形态正常(见图1)。TUNEL染色阳性细胞胞核中出现棕黄色颗粒，实验组海马CA1区可见3～4层锥体细胞，排列整齐，细胞密度大，核大而圆，核仁清晰，核膜光滑完整，细胞结构未见异常 (见图3)，对照组脑海马可见大量凋亡的神经细胞神经元染色质集聚、浓缩、周边化，有些近于完全崩解，胞质高度肿胀、扩张、内容物明显减少，甚至空化,出现大量出现棕黄色颗粒(见图4)。幼兔大脑皮层.海马中凋亡细胞计数及统计分析见表1，结果显示，与对照组相比，实验组海马以及皮层神经细胞凋亡程度明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05) 。

    2.2  不同组血清S100β蛋白含量测定  在深低温停循环后T2、T3、T4、T5、T6，实验组与对照组相比，血清S100β蛋白含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05),见表2,图5。表1  两组海马与皮层凋亡细胞比较

    3  讨  论

    脑缺血模型的制备，利用结扎双侧颈总动脉与锁骨下动脉来制作DHCA模型模拟临床状况，在本实验中证明是合理、实用、、可行的。

    脑细胞缺氧缺血后的损伤可分为由急性能量衰竭造成细胞坏死及迟发性神经元损伤两个阶段。迟发性神经元死亡以细胞凋亡为主，细胞凋亡在脑缺血再灌注后30 min即出现，24～48 h达到高峰。神经生长因子［5］是神经系统重要的生物活性分子之一，它本身是一种调节因子，影响着中枢神经系统某些神经元的存活和分化，可以促进神经元的成熟和修复、维持神经细胞生存和行使机能，在病理状态下可挽救缺血损伤的神经元细胞。近年来的一些研究［6］发现无论短暂性或持续性脑缺血，均有内源性NGF表达增加，但表达增加的时程很短，表达水平有限，难以对受损神经元起到全面而持久的保护作用。根据多次预实验，出NGF 0.5 μg/kg 可以取得比较理想的脑保护效果。本实验结果表明外源性NGF处理对DHCA后神经细胞凋亡有抑制作用，能明显减轻脑缺血再灌注引起的神经细胞凋亡，从而在DHCA下起到脑保护作用。

    NGF的给药途径影响脑保护的作用。一般情况下NGF不易通过血脑屏障，但是在DHCA情况下，血脑屏障通透性增加；而幼兔本来血脑屏障发育不完善，NGF可以通过血脑屏障在脑组织中达到较高的浓度，发挥有效作用。本实验证明通过静脉给予外源性NGF，可对幼兔缺血神经组织起保护作用。此结果为DHCA下NGF的脑保护作用提供了理论依据。

    血清S100β蛋白是心脏术后［7］脑损伤的重要标记物，心脏手术后测定其血清浓度有助于诊断脑损伤。近年认为，当中枢神经系统细胞损伤时，S100β蛋白从胞液中渗出进入脑脊液，再经受损的血脑屏障进入血液。因此，脑脊液和血液中的S100β蛋白是中枢神经系统损伤特异的和灵敏的生化标志。血清S100β蛋白相当稳定，其检测结果不受肝素、鱼精蛋白、异丙酚以及溶血的影响，所以在行心肺转流术的外科手术中随时可取样测定。不论在室温或4℃、转流前或转流后，血样储存48 h以内，其结果均可靠。检测方法简便易行，成本低廉，能够随机进行动态观察。最近研究表明，因黑色素瘤、肌上皮细胞、乳腺癌细胞、软骨细胞和脂肪细胞等均有S100β的表达，给本实验结果一定干扰，由于设立了随机对照，所以可以排除。在DHCA后T2至T6的 5个时间窗，实验组血清S100β蛋白含量明显低于对照组，而T7至T9时间窗两组之间则无表2  两组不同时间点血清S100β蛋白含量对比 注：两组比较* P<0.05,** P<0.01显著差别，并且回落到正常水平，可能的原因是：①S100β蛋白半衰期为2 h，其长期观测的价值尚待证实；②缺血-再灌注损伤影响逐渐减小，脑细胞形态与功能逐渐恢复。

    本实验提示，在DHCA围手术期采取神经生长因子等综合干预措施，有可能阻断或减轻脑细胞凋亡过程，从而减轻脑损伤程度，减少或避免DHCA神经后遗症的发生。

【】
  ［1］ Takman R, Jiang H, Schaefer E, et al. Nerve growth factor pretreatment attenuates oxygen and glucose deprivation-induced c-Jun amino-terminal kinase 1 and stress-activated kinases p38 alpha and p38 beta activation and confers neuroprotection in the pheochromocytoma PC12 model ［J］. J Mol Neurosci, 2004, 22(3):237-250.

［2］ Grundy PL, Patel N, Harbuz MS,et al. Glucocorticoids modulate the NGF mRNA response in the rat hippocampus after traumatic brain injury ［J］. Brain Res,2001, 892(2):386-390.

［3］ Bui NT, Konig HG, Culmsee C,et al. p75 neurotrophin receptor is required for constitutive and NGF-induced survival signalling in PC12 cells and rat hippocampal neurones ［J］. J Neurochem, 2002,81(3):594-605.

［4］ Georgiadis D, Berger A, Kowatschev E,et al. Predictive value of S-100beta and neuron-specific enolase serum levels for adverse neurologic outcome after cardiac surgery ［J］. J Thorac Cardiovasc Surg,2000 ,119(1):138-147.

［5］ Petruska JC, Mendell LM.The many functions of nerve growth factor: multiple actions on nociceptors ［J］.Neurosci Lett , 2004, 361(1-3): 168-171.

［6］ Nagy Z, Simon L, Bori Z. Regulatory mechanisms in focal cerebral ischemia. New possibilities in neuroprotective therapy ［J］. Ideggyogy Sz,2002,55(3-4):73-85.

［7］ Ali MS, Harmer M, Vaughan R. Serum S100 protein as a marker of cerebral damage during cardiac surgery ［J］. Br J Anaesth, 2000,85(2): 287-298.