反向钠钙交换体在大鼠心脏钙预处理中的作用

          作者：毕生辉， 金振晓， 王喜明， 周京军， 彭道荣， 魏旭峰，段维勋，易定华

【摘要】  目的 探讨钙预处理时反向钠钙交换体对抗钙矛盾损伤的作用及机制。方法 25只SD大鼠随机等分为5组：正常对照 (Control)组、钙矛盾 (Ca PD)组、钙预处理 (CPC)组、反向钠钙交换体抑制剂（KB-R7943）+CPC组和KB-R7943+Ca PD组。采用离体大鼠心脏Langendorff逆行灌注模型，观察各组心脏冠状动脉流量 (CF)、左心室压 (LVDP)、左心室内压变化速率 (dp/dt)及冠状动脉循环流出液心肌肌钙蛋白I (cTnI)浓度的变化，HE染色观察各组心脏组织形态。结果 与Ca PD组相比，CPC组CF、LVDP、dp/dt均显著提高 (P<0.001)，冠状动脉循环流出液中cTnI水平显著降低 (P<0.001)。而钙预处理过程中加入反向钠钙交换体抑制剂KB-R7943，其心肌保护作用均被明显减弱 (P<0.05)。结论 钙预处理能够有效对抗钙矛盾对心肌造成的损伤，其机制涉及钙预处理时钠钙交换体反向交换活性的上调。

【关键词】  心脏；大鼠；钠钙交换体；钙预处理；钙矛盾

    Abstract: OBJECTIVE   To investigate the role of reverse mode Na+/Ca2+ exchanger on the cardioprotection of calcium preconditioning (CPC). METHODS  The hearts of twenty-five SD rats were  isolated, underwent Langendroff perfusion, and were randomized into 5 groups: (1) control group (65 min perfusion with KH buffer), (2) calcium paradox group (5 min perfusion with KH buffer lacking Ca2+  followed by 30 min KH buffer containing Ca2+ , Ca PD), (3) calcium preconditioning group (5 cycles perfusion of 1 min Ca2+  depletion/5 min Ca2+  repletion+ Ca2+  PD,CPC), (4) reverse mode Na+/Ca2+  exchanger inhibitor KB-R7943 (3 μmol/L)+CPC group (addition of KB-R7943 during calcium preconditioning). (5) reverse mode Na+/Ca2+  exchanger inhibitor KB-R7943 (3 μmol/L)+Ca PD group (30 min perfusion with KH buffer containing KB-R7943+Ca PD). Left ventricular developed pressure (LVDP), rate of rise of left ventricular pressure (dp/dt), coronary flow (CF), and cardiac troponin I (cTnI) release were measured. Sections with HE staining were analyzed to display the morphologic structures of the hearts.  RESULTS  The levels of LVDP,dp/dt, and CF of the CPC group were significantly higher than those of the Ca PD group ( all P<0. 001). The release of cTnI was reduced significantly in the CPC group as compared to the Ca PD group (P<0.001). However, the improvement of the hemodynamics and the decrease in the cTnI release elicited by calcium preconditioning were significantly attenuated by the reverse mode Na+/Ca2+  exchanger inhibitor KB-R7943 employed during the whole process of the calcium preconditioning (all P<0.05). CONCLUSION  The enhancement of reverse mode Na+  exchanger was involved in the cardioprotection induced by calcium preconditioning in the isolated rat heart model.

    Key words：  Heart;Rat;Na+/Ca2+ exchanger; Calcium preconditioning; Calcium paradox对离体灌注的大鼠心脏给予一段时间的无钙液灌注，随即再恢复为有钙液灌注，会迅速出现严重心肌损伤［1］，这种现象就是钙矛盾（calcium paradox）。和缺血－再灌注损伤相似，钙矛盾损伤也可以引起受损心肌细胞内钙超载［2］，进而导致细胞死亡，研究表明：细胞坏死和细胞凋亡均参与了钙矛盾引起的心肌细胞死亡［3-4］。预先给予数个循环的短暂无钙液－有钙液交替灌流即钙预处理，能够有效对抗随后的钙矛盾损伤［5］，由于心肌细胞内Ca2+负荷的适当增加可能触发心肌保护作用［6］，而反向钠钙交换体是钙矛盾复钙灌注期间Ca2+进入心肌细胞内的最主要途径［7］。因此，我们提出假设：钙预处理时钠钙交换体反向交换活性的上调参与了钙预处理对抗心肌钙矛盾损伤的保护作用，并就此给予进一步研究。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及主要试剂  实验动物为清洁级雄性SD大鼠25只，体重220～250 g，由第四军医大学实验动物中心提供。反向钠钙交换体抑制剂KB-R7943购于tocris公司。KH缓冲液成分 (mmol/L)：NaCl 118，KCl 4.7，CaCl2 2.5，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25，葡萄糖5.5；无钙KH缓冲液成分 (mmol/L)：NaCl 118，KCl 4.7，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25，葡萄糖 5.5，Na2EDTA 0.2。灌流前50 min以体积分数为95 % O2 和5 %CO2 混合气体向储液罐内的灌流液中持续通气直至实验结束，灌流液温度维持在37℃，pH维持在7.35～7.45 。

    1.2  离体心脏灌注模型的建立  腹腔注射3%戊巴比妥30 mg/kg、肝素500U/kg，大鼠麻醉后迅速开胸取心脏，立即放入预冷的KH缓冲液（4℃），将主动脉根部迅速固定于灌注管口，37℃下KH液逆行恒压灌注，灌注压为80 mmHg。心脏复跳后于左心耳处剪一小口，将带有乳胶水囊的测压管经二尖瓣插入左心室，连接压力换能器 (MP100,BIOPAC Systems,Inc.)，调节水囊使左心室舒张末压 (left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)为10mmHg左右，心脏经平衡灌注10 min，待心跳稳定后记为灌注开始，再按分组灌注。

    1.3  实验分组  随机等分为5组：①对照 (Control)组：以KH缓冲液持续灌注65min；②钙矛盾(Ca PD)组：以KH缓冲液持续灌注30min后改用无钙KH缓冲液灌注5min，再改用正常KH缓冲液灌注 (即复钙灌注)30min；③钙预处理(CPC)组：以无钙KH缓冲液灌注1min后改用正常KH缓冲液灌注5min，上述操作重复5个循环后用无钙KH缓冲液灌注5min，再改用正常KH缓冲液灌注30min；④KB-R7943并CPC组：以含KB-R7943 3μmol/L的无钙KH缓冲液灌注1min后改用含相同浓度KB-R7943的正常KH缓冲液灌注5min，上述操作重复5个循环后用无钙KH缓冲液灌注5min，再改用正常KH缓冲液灌注30min；⑤KB-R7943并Ca PD组：以含KB-R7943 (3μmol/L)的KH缓冲液灌注30min后改用无钙KH缓冲液灌注5min，再改用正常KH缓冲液灌注30min。

    1.4  检测指标及方法  实验全程记录左心室内压变化速率 (rate of rise of left ventricular pressure,dp/dt)、LVEDP、左室压力 (left ventricular pressure,LVP)、左室收缩峰压 (left ventricular peak systolic pressure, LVPSP)，左心室发展压 (left ventricular developed pressure, LVDP)=LVPSP-LVEDP；测定灌注开始及灌注结束各组心脏的冠状动脉流量 (coronary  flow, CF)。

    收集灌注开始及灌注后第20 min、32 min、36.5 min、40 min、65 min的冠状动脉循环流出液，检测心肌肌钙蛋白I (cardiac troponin I, cTnI)浓度。

    心肌病理组织制作HE染色病理切片，光镜下观察心肌组织学形态。

    1.5  统计处理  以SPSS 13.0 统计软件进行统计分析，实验结果以(±SD)表示；差异显著性检验采用单因素方差分析，比较二组间差异用LSD-t检验。

    2  结  果

    2.1  血流动力学指标  心脏灌注开始时各组血流动力学各项指标的基线水平无显著差异。灌注结束时血流动力学指标恢复率平均值 (%) Ca PD组较Control组均显著降低，P<0.001；CPC组较Ca PD组均显著升高，P<0.001；KBR+CPC组较CPC组均显著降低，P<0.001，较Ca PD组均显著升高，P<0.05；Ca PD组和KBR+Ca PD组间无显著性差异。见图1。

    2.2  冠状动脉循环流出液cTnI浓度  复钙灌注前各组心脏冠状动脉循环流出液cTnI浓度平均值间无显著差异。复钙灌注后cTnI浓度平均值Ca PD组较Control组显著升高，以36.5 min和40 min最为明显，均P<0.001；CPC组较Ca PD组显著降低，以36.5 min和40 min最为明显，均P<0.001；KBR+CPC组较CPC组显著升高，以40 min为甚，P<0.001，较Ca PD组显著降低，均P<0.01。见图2。

    2.3  光镜下心肌组织形态   光镜下Control组心肌细胞结构完整，细胞边缘清晰，胞浆染色均匀，细胞核清晰可见；Ca PD组及KBR+Ca PD组镜下可见弥漫的心肌细胞溶解、碎裂，可见裸核，残存心肌细胞胞浆浓缩、胞核深染，呈过度收缩态；CPC组大部分心肌细胞结构尚完整，但细胞边缘模糊，细胞结构不清，有少数细胞胞浆溶解，细胞碎裂；KBR+CPC组镜下可见大量心肌细胞碎裂、崩解，残存的心肌细胞胞浆淡染。见图3。

    3  讨  论

    本研究以离体灌流的大鼠心脏为研究对象，通过记录分析血流动力学各项指标反映离体心脏的整体功能；通过检测不同灌注时段冠状动脉循环流出液中cTnI浓度反映心肌细胞坏死程度；通过观察光镜下心肌组织形态直接反映心肌细胞的损伤情况。显示：钙预处理能够有效对抗钙矛盾损伤，其心肌保护作用包括改善离体心脏的整体功能及有效减轻心肌细胞坏死，而钠钙交换体的反向交换模式全面参与了钙预处理这一系列的心肌保护作用。

    钠钙交换体在维持心肌细胞内钙稳态中扮演重要角色，它有钙外排和钙内流两种交换模式。钙外排模式也叫正向交换模式，它参与了正常心肌舒张期的Ca2+外排［8］；钙内流模式也叫反向交换模式，目前已证实Ca2+经反向钠钙交换体进入细胞是心肌缺血－再灌注损伤和钙矛盾损伤的重要原因［7,9-11］。无论是缺血－再灌注还是钙矛盾，在给心肌细胞造成损伤的同时也可以激活心肌细胞固有的内源性保护机制，这可能就是缺血预处理和钙预处理具备心肌保护作用的一个重要原因；钙预处理表观上看是连续数次的微型钙矛盾处理，其心肌保护作用主要在于使心肌能够适应并耐受随后更为严重的钙矛盾损伤。本实验结果表明：通过抑制反向钠钙交换体减少钙预处理期间进入心肌细胞内的Ca2+可抵消钙预处理的心肌保护作用，因此钙预处理的实质可能是通过适度增加心肌细胞内的Ca2+负荷，激活心肌细胞内源性保护机制，使得心肌细胞能够适应并耐受随后更为剧烈的细胞内Ca2+负荷的增加；这可能也是其他形式预处理共同具备的特征，也就是说不同形式预处理的心肌保护作用可能存在着一定程度的交叉，这一推断已得到了相关研究的支持：缺血预处理不仅可以减轻心肌缺血－再灌注损伤，而且也可以一定程度地对抗钙矛盾损伤［12］，而钙预处理的心肌保护作用同样适用于缺血－再灌注损伤和钙矛盾损伤［13］。本项研究的不足之处在于未能对各组心肌细胞内Ca2+的含量进行检测，以更加直观的证据支持这一论断。

    本实验结果还表明：反向钠钙交换体抑制剂KB-R7943对钙预处理心肌保护作用的抵消是部分性的，究其原因，可能有以下两个方面：①实验中浓度为3μmol/L的KB-R7943未能完全抑制钙预处理过程中钠钙交换体的反向转运活性，这些未被抑制的反向钠钙交换体仍然可以介导钙预处理的部分心肌保护作用；②除了钠钙交换体反向交换活性的上调外，钙预处理还可能通过其他机制实现其心肌保护作用。 关于钙预处理时钠钙交换体反向交换活性的上调如何进一步引发心肌保护作用，尚需更深入的研究。

【】
  ［1］ Zimmerman AN, Hulsmann WC. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart ［J］. Nature, 1966, 211(5049): 646-647.

［2］ Piper HM.The calcium paradox revisited: An artefact of great heuristic value［J］.Cardiovasc Res,2000, 45(1):123-127.

［3］ Ziegelhoffer A, Ravingerova T, Tribulova N,et al. Partial prevention of calcium paradox in isolated perfused rat hearts by diltiazem［J］. Biomed Biochim Acta, 1989, 48(2-3): S96-101.

［4］ Xu YJ, Saini HK, Zhang M,et al. MAPK activation and apoptotic alterations in hearts subjected to calcium paradox are attenuated by taurine ［J］. Cardiovasc Res, 2006, 72(1): 163-174.

［5］ Ashraf M,Suleiman J,Ahmad M.Ca2+ preconditioning elicits a unique protection against the Ca2+ paradox injury in rat heart.Role of adenosine Fixed ［J］. Circ Res,1994,74(2):360-367.

［6］ Bouwman RA, Salic K, Padding FG,et al. Cardioprotection via activation of protein kinase C-delta depends on modulation of the reverse mode of the Na+/Ca2+ exchanger［J］. Circulation, 2006, 114(1 Suppl): I226-232.

［7］ Chatamra KR,Chapman RA. The effects of sodium-calcium exchange inhibitors on protein loss associated with the calcium paradox of the isolated Langendorff perfused guinea-pig heart ［J］. Exp Physiol,1996,81(2):203-210.

［8］ Shigekawa M,Iwamoto T.Cardiac Na+-Ca2+ exchange : molecular and pharmacological aspects［J］. Circ Res, 2001, 88: 864-876.

［9］ Imahashi K,Pott C,Goldhaber JI,et al. Cardiac-specific ablation of the Na+-Ca2+ exchanger confers protection against ischemia/reperfusion injury［J］.Circ Res,2005,97(9):916-921.

［10］ Namekata I,Shimada H, Kawanishi T,et al. Reduction by SEA0400 of myocardial ischemia-induced cytoplasmic and mitochondrial Ca2+ overload ［J］. Eur J Pharmacol, 2006, 543(1-3): 108-115.

［11］ Takahashi K,Takahashi T,Suzuki T,et al. Protective effects of SEA0400, a novel and selective inhibitor of the Na+/Ca2+ exchanger, on myocardial ischemia-reperfusion injuries ［J］. Eur J Pharmacol, 2003, 458(1-2): 155-162.

［12］ Kawabata K, Osada M, Netticadan T,et al. Beneficial effect of ischemic preconditioning on Ca2+ paradox in the rat heart ［J］. Life Sci, 1998, 63(8): 685-692.

［13］ Miyawaki H,Zhou X,Ashraf M.Calcium preconditioning elicits strong protection against ischemic injury via protein kinase C signaling pathway ［J］.Circ Res,1996,79(1):137-146.