肿瘤干细胞研究新进展
【摘要】 随着肿瘤研究的深入，研究者提出了“肿瘤干细胞”学说，该学说认为一小部分具有干细胞特性的肿瘤细胞在肿瘤的发生﹑中起着非常重要的作用，目前已经在一些实体瘤中分离鉴定出了这部分细胞并命名为“肿瘤干细胞”，但是关于这群细胞的分选鉴定技术还不完善。
【关键词】 肿瘤干细胞；实体瘤；分选；鉴定
目前，有关干细胞的研究已经深入到生命的各个领域，在一些疾病的临床诊断和上取得了突破性的进展。所谓“干细胞”是指一种早期未分化细胞，具有自我更新和多向分化潜能的一类细胞。干细胞的研究推动了肿瘤学的发展，研究者发现肿瘤细胞与干细胞有许多相似之处，因此提出了“肿瘤干细胞”理论，并在某些肿瘤中分离出了肿瘤干细胞，为肿瘤的研究开辟了新方向。
1 肿瘤干细胞理论的提出
肿瘤干细胞理论的提出和证实源于对白血病的研究，20世纪70年代，Park CH等证实：极少的白血病细胞能形成克隆细胞株，由于条件的限制没有分离出这部分 细胞。1997年，Bonnet和Dick等［1］从白血病患者体内分离出一类表面标志为CD34＋CD38ˉ的细胞，此类细胞具有明显的增殖分化、自我更新能力，可在非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷（non-obese diabetes/serve combined immunodeficiency，NOD/SCID）小鼠体内形成白血病，在白血病细胞中比例很小约0.2%，而其他类型的白血病细胞不能在小鼠体内长出肿瘤，证实了白血病干细胞的存在并明确地提出了“白血病干细胞”［2］的概念；2001年，大量肿瘤细胞和干细胞的生物学相似性后，提出“肿瘤干细胞”［2］理论，该理论认为肿瘤组织由异质性的细胞群体组成，其中很小部分细胞具干细胞特性，决定肿瘤的发生、侵袭、转移、播散和对各种治疗是否敏感，而其他大部分细胞则经过有限的几次增殖后衰亡失去形成肿瘤的能力。
2 肿瘤干细胞在实体瘤中的研究进展
2.1 乳腺癌 Al-Hajj等［3］发现乳腺癌是由不同 表型的癌细胞组成，只有一小部分癌细胞具有强致瘤性接种NOD/SCID 小鼠后能致瘤。研究报道：这群细胞的表型为Lin-ESA+CD44+CD24-/low，占乳腺癌细胞总数的2%，具有很强的致瘤性，100个Lin-ESA+CD44+CD24-/low表型的细胞可在NOD/SCID小鼠体内形成移植瘤，而20，000个其他表型的细胞也不能致瘤，但这两种表型不同的细胞在形态上没有明显差别；此外，还发现在Lin-ESA+CD44+CD24-/low子代细胞中保留有一定比例的与原代细胞表型相 同的细胞。这一研究结果首次证明在实体瘤中存在肿瘤干细胞，并且表明肿瘤干细胞可以自我更新和分化成为不同表型的肿瘤细胞。
2.2 脑肿瘤 2003年Singh等［4］报道在脑肿瘤中分离出肿瘤干细胞，他们从原代培养的成神经管细胞瘤、毛细胞性星形细胞瘤、神经节神经胶质瘤等肿瘤中分选出了肿瘤干细胞，这群细胞CD133和nestin的表达阳性，能形成神经 球，拥有自我复制和多向分化能力，表达与神经干细胞有关的基因，产生表型各异的子细胞；此外研究者也对CD133+和CD133－脑肿瘤细胞的致瘤能力进行了比较，CD133+细胞只需100个即可在NOD/SCID小鼠体内致瘤并且产生的肿瘤与病人的原始肿瘤类似，而100，000个CD133－细胞不能致瘤。也有研究报道了同类结果［5］，提示脑肿瘤干细胞除了表达CD133，还具有Sox-2、musashi-1、Bmi-1、nestin、melk、 PSP、磷酸丝氨酸磷酸化酶等神经干细胞和其他干细胞的基因特征。
2.3 胰腺癌 Chenwei Li等［6］在胰腺癌的研究中发现：胰腺癌细胞中有一表面标志为CD24+CD44+ESA+的细胞亚群，这群细胞占癌细胞总数的0.2%～0.8%，其致瘤能力比其他的癌细胞强100倍，100个CD24+CD44+ESA+细胞可在胰尾的原位注射中形成与人类胰腺癌免疫组化结果相同的肿瘤，并具有干细胞特性：如自我更新能力、Shh信号通路的上调。因此，他们认为表面标志为CD24+CD44+ESA+的这群胰腺癌细胞就是胰腺癌干细胞。
2.4 霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma , HL) RS细胞是HL的病理标志性细胞。Richard J.Jones ［7］等在研究HL细胞株（L428，KM-H2）和HL患者病理组织中发现一细胞亚群，约占癌细胞总数的5%、有很强的ALDH活性、表达记忆B细胞的表面标志（CD19+CD20+CD27+）、拥有HL主要的成瘤能力，而在病理切片中占绝大部分的RS细胞不能促进和维持肿瘤的生长。因此，他们认为在HL中这些高表达ALDH活性的记忆B细胞可能就是HL干细胞。
2.5 恶性黑色素瘤 E Monzani等［8］首次从人类的恶性黑色素瘤组织及细胞株WM115中分离出表面标志为CD133+ABCG2+的恶性黑色素瘤起始细胞，这群细胞占黑色素瘤组织中癌细胞总数的1%左右、呈悬浮球状生长﹑可在NOD／SCID小鼠体内形成Mart-1+的肿瘤。
2.6 直肠癌 CA O’Briend 等［9］在NOD/SCID体内运用肾被膜移植实验鉴定了人类直肠癌的起始细胞(CC-IC)。纯化实验证实所有的CC-ICs是CD133+，CD133－细胞组成肿瘤的主要部分但不能促使肿瘤生长。通过有限稀释法发现：CD133+细胞中所含的CC-IC的是整个肿瘤细胞中CC-IC的200倍。在CD133+细胞群中的CC-ICs在连续的移植中能维持生长以及分化和重建肿瘤的异质性。
2.7 卵巢癌 印度研究者［10］从一名63岁卵巢浆液性腺癌病人腹水中分离出癌细胞并进行体外培养，共产生65个克隆，其中19个克隆自发的永生下去。进一步研究发现，其中两个克隆A2和A4-T癌细胞nestin和Nanog（维持细胞未分化状态的转录决定子）阳性表达，可以自我更新产生新的克隆，在体外悬浮培养可以分化成球体，裸鼠体内接种可致瘤并可连续裸鼠间传代，在裸鼠体内形成的肿瘤非常类似于病人的原始卵巢癌，说明这两个转化的克隆代表了卵巢癌干细胞。
目前许多实体瘤中的肿瘤干细胞没有分离出来,但随着科学技术的发展，有望在实体瘤的干细胞研究中取得突破。
3 肿瘤干细胞的分选
肿瘤干细胞的研究处于初级阶段，分选技术尚未成熟。目前,采用的分选技术为两种：其一是流式分选技术,其二是磁式分选技术,其中流式分选技术被广泛应用。流式分选技术是指使用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的一项新技术。此项技术有赖于细胞表面标志物的识别,采取的主要策略有以下几种。
3.1 利用细胞表面的蛋白标记物及特异抗体进行分选 研究表明：一些膜表面蛋白如CD117、CD133、CD34、Nestin、Nanog、Oct4等可在多种干细胞中表达，用其中的一种或几种不同的荧光素标记的单克隆抗体标记单细胞悬液后，可用FACS分选，如AML［1］、脑瘤［4］、乳腺癌［3］、室管膜瘤［11］等肿瘤干细胞的研究中运用了此种策略。
3.2 利用SP细胞亚群的分析或许可作为干细胞分选的手段［12］ 研究发现：SP细胞在肿瘤总细胞中极少并表达不同种类的ATP结合盒（ATP-binding cassette， ABC）转运蛋白,如MDR1和BCRP,导致其对化疗药物的天然抵抗;在肿瘤治疗中如果靶向清除SP细胞能提高肿瘤疗效。此外,SP细胞在干细胞中非常丰富其致瘤性很强、在肿瘤发展中具有重要作用。因此,SP细胞亚群可作为干细胞深入研究的有力工具。目前,在肝癌［13］、甲状腺癌［14］、多发性骨髓瘤［15］等的研究中就是采用这种方法对肿瘤干细胞进行初步的筛选。
3.3 利用干、祖细胞中ALDH的含量较高进行分选 ALDH即醛脱氢酶,是存在于胞液中的一种氧化还原酶,主要对细胞内的醛进行氧化，在酒精和维生素A的氧化及环磷酰胺耐药中均有重要作用。有研究表明：在造血系统［16］、神经系统［17］ 的干、祖细胞中ALDH含量很高；最近在乳腺癌［18］的研究中也发现：高ALDH活性的正常乳腺上皮细胞具有干细胞的特性,可在NOD／SCID小鼠体内形成乳球和导管小叶结构。在人类乳腺癌的异种移植中，ALDH+细胞也具有癌干细胞的特征:其约占细胞总数的1%～10%、其致瘤性很强，200个ALDH+的细胞可在NOD／SCID小鼠体内形成肿瘤,而且新形成的转移瘤中具有与原发肿瘤相同的ALDH基因表达图谱,但2×103个ALDH－细胞也不能形成转移瘤。此外,利用肿瘤组织的微阵列分析也发现ALDH+的乳腺癌临床预后差。目前临床上使用测定ALDH的活性为乳腺癌的早期发现提供有力支持。
3.4 抗凋亡或许可作为分选肿瘤干细胞的手段［19］ 肿瘤干细胞是肿瘤中存在的极少数具有自我更新和繁殖能力等干细胞特性的细胞亚群，这一亚群细胞是肿瘤生长的“种子”。而在肿瘤中占绝大多数的肿瘤细胞经过有限的增殖和更新后则凋亡。因此，C Wei等［19］设想利用肿瘤干细胞的抗凋亡特点去分选肿瘤干细胞。在凋亡诱导模型中，肿瘤干细胞的比例会增加，相应的肿瘤干细胞表面标志也会增加。因此，通过比较肿瘤细胞表达的表面分子的变化，或许能发现肿瘤干细胞。
4 肿瘤干细胞的鉴定
目前，难以从形态学角度对肿瘤干细胞进行鉴定，只能从功能学方面进行分析。现在的鉴定方法一般包括以下两个方面。
4.1 利用肿瘤干细胞的生物学特性在体外培养进行初步的鉴定 即体外培养的肿瘤干细胞是否呈悬浮球状生长、是否具自我更新和增殖能力、是否具多向分化潜能。目前有研究［20］表明：肿瘤干细胞易呈悬浮球状生长并且可连续传代，在传代的后期更易出现悬浮球状生长且增殖速度加快；此外，通过有限稀释实验和亚克隆培养分析发现所有亲本肿瘤球制成的细胞悬液都再次形成肿瘤球，且与亲本肿瘤球完全相同，提示肿瘤干细胞具有自我更新和增殖能力；肿瘤干细胞转移至含血清的培养基中培养7天左右，便不再或极少表达Nestin和CD133,而这两种标记物现在普遍被认为是在干细胞或是祖细胞中表达的，表明了干细胞具有多向分化潜能。在乳腺癌［3］、脑肿瘤［4，20］等的研究中应用这些方法进行初步的鉴定。
4.2 测定体外克隆形成能力鉴定肿瘤干细胞 即将初步鉴定出的肿瘤干细胞注入NOD/SCID小鼠体内，从而观察其致瘤性；如白血病［1］、乳腺癌［3］、脑胶质瘤［4，20］、前列腺癌［21］等的肿瘤干细胞的鉴定均在NOD/SCID小鼠体内重建模型，此种方法认为是现在进行肿瘤干细胞鉴定的最具说服力的方法。
总之，肿瘤干细胞已成为肿瘤研究的热点，对肿瘤的也要从新视角把握。肿瘤干细胞的发现无疑给家对肿瘤的认识带来了新观念，为肿瘤的临床治疗带来了希望，相信随着对肿瘤干细胞的深入研究人类最终会取得胜利。
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