低剂量颗粒溶素对单核细胞和T细胞具有趋化作用
作者：陈燕，娄加陶，钱琤，周晔，陈波，蒋天舒，谷明莉，仲人前，邓安梅
【摘要】 目的 探讨低剂量颗粒溶素（GNLY）对免疫细胞的趋化作用。方法 抽取健康人全血，分离出外周血单个核细胞（PBMC），经免疫磁珠法纯化出单核细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD45RA+T细胞、CD4+/CD45RO+T细胞、CD8+/CD45RA+T细胞和CD8+/CD45RO+T细胞，再用96孔微孔趋化板进行趋化反应。结果 颗粒溶素可趋化一些T细胞系、单核细胞系，趋化指数≥2（P<0.05），而对B细胞系的趋化指数为<2。用百日咳毒素预处理过的T细胞系、单核细胞系不再对颗粒溶素有反应，提示颗粒溶素介导的趋化作用涉及G蛋白偶连受体。结论 颗粒溶素不仅是一种细胞毒性分子，而且具有化学趋化作用。颗粒溶素在10~100 μmol 发挥细胞毒活性而在相对较低的浓度下发挥趋化作用且此效应涉及G蛋白偶连受体。
【关键词】 颗粒溶素；免疫细胞；趋化作用
颗粒溶素（granulysin，GNLY）是脂结合蛋白中皂素样蛋白的成员之一，在机体免疫应答过程中，与穿孔素和颗粒酶等颗粒成分，一起参与抗菌、抗病毒及杀伤肿瘤细胞等免疫应答过程[1]。颗粒溶素以相对分子质量15 000和9 000两种形式表达于CTL和NK细胞中、相对分子质量15 000的片段经蛋白酶解后转变成相对分子质量9 000的蛋白[2]。研究表明重组的相对分子质量9 000的蛋白可以诱导有核细胞的凋亡[3]。颗粒溶素的局部浓度对于其生物活性非常重要，临床和科研中常用浓度为10~100 μmol，主要引起细胞毒活性和细胞凋亡。我们在实验中发现，低剂量的颗粒溶素对单核细胞系、一些T细胞系具有趋化作用，而对B细胞系没有趋化作用。
1 材料和方法
1．1 重组颗粒溶素的制备
颗粒溶素制备参见[4]。将编码颗粒溶素的cDNA克隆至pET28a+ vector (Novagen)并转入大肠埃希菌BL21中表达。经异丙基硫代?β?D?半乳糖苷（IPTG）诱导表达3 h 后，收集包涵体蛋白，变性后经Ni2+柱纯化重组蛋白，经复性、透析、HPLC柱纯化后得到颗粒溶素蛋白，经检测其内毒素水平低于1.0 EU/μg 颗粒溶素。
1.2 细胞培养
5例T细胞系和5例单核细胞系由ATCC获得。在含10%FBS的RPMI 1640中培养（含2 mmol 谷氨酰胺100 U/ml 青霉素，100 mg/L 硫酸链霉素）。在对数生长期收集细胞，经RPMI 1640洗3次后，进行趋化反应分析。
1.3 PBMC的分离和纯化
经Ficoll?Hypaque（聚蔗糖-泛影葡胺）密度梯度分离PBMC，用免疫磁珠法纯化出单核细胞、CD4+T 细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD45RA+T细胞、CD4+/CD45RO+T细胞、CD8+/CD45RA+T细胞和CD8+/CD45RO+T细胞。采用FACS分析表型，将纯度>90%的样品进行下一步实验。
1.4 趋化反应
用96孔微孔趋化板检测细胞的迁移率。实验设实验组，空白组和阳性对照组：将含1% BSA的RPMI 1640重悬细胞(1×106 cells/ml)100 μl 加于上层板中，将不同浓度的颗粒溶素放置于下层板中，以RPMI 1640为空白对照，以RANTES为阳性对照。用5μm聚碳酸酯滤纸膜分离上下两层板。用含10 mg/L 纤维结合素的RPMI 1640，包被5 μm 滤膜后，4 ℃ 过夜。在37 ℃ 孵育细胞1.5 h（单核细胞）或3 h（T细胞），收集迁移至下层的细胞，离心后取沉淀。用CyQuant GR染料进行定量，计数细胞数。趋化指数定义为检测孔的细胞数除以阴性对照孔细胞数的值。统计方法用t检验。趋化指数为≥2时，P<0.05。
2 结果
2.1 颗粒溶素可趋化一些T细胞系、单核细胞系，但对B细胞系没有趋化作用
经96孔微孔趋化板分析后发现，颗粒溶素可趋化一些T细胞系、单核细胞系，而且在颗粒溶素10 nmol 时，趋化指数达到峰值，而颗粒溶素发挥细胞毒作用的浓度在10~50 μmol，颗粒溶素对B细胞系的趋化指数<2。加入抗颗粒溶素抗体后，可阻断颗粒溶素的趋化效应，证实上述趋化作用的特异性。见图1。
2.2 颗粒溶素对原代细胞的趋化作用
免疫磁珠法分离单核细胞、CD4+T 细胞和CD8+T 细胞，进行趋化指数试验。结果表明，颗粒溶素趋化原代单核细胞（趋化指数约为4.0），可同时趋化CD4+T细胞和CD8+T细胞（趋化指数约为3.0），颗粒溶素在10 nmol 时，趋化活性达到峰值。进一步研究发现，颗粒溶素的趋化性在有无血清中无明显差异。在CD4+T细胞和CD8+T细胞得到记忆细胞(CD45RO+)和天然细胞(CD45RA+)中，只有CD45RO+T细胞产生趋化作用，其余细胞没有趋化作用。见图2~3（并且10 nmol 为颗粒溶素趋化达到峰值时的浓度，并且P值均<0.05,趋化指数≥2）。
2.3 百日咳毒素可抑制颗粒溶素对单核细胞和T细胞的趋化作用
为探讨颗粒溶素趋化效应途径，采用百日咳毒素预处理细胞，进行趋化试验。结果表明，颗粒溶素趋化效应被阻断，经百日咳毒素预处理过的T细胞、单核细胞不再发生迁移，提示颗粒溶素趋化效应涉及G蛋白偶连受体。
3 讨论
颗粒溶素（granulysin，GNLY）是人类CTL和NK细胞释放的新的效应分子，具有广谱的抗菌活性并能够杀伤肿瘤细胞。GNLY是一个防御分子，可以导致细胞膜通透性增加裂解，它杀伤病原体的能力取决于其与细胞壁的直接作用。它快速杀伤许多微生物，并且既能杀胞外菌，也能杀胞内菌［4~6］。GNLY是在抗原激活CD8+CYLs时分泌的，因此是特异性免疫应答的武器。颗粒溶素可趋化T细胞系、单核细胞系，趋化指数均≥2，并且P<0.05。颗粒溶素对B细胞没有趋化作用，抗颗粒溶素抗体可阻断趋化作用。在颗粒溶素作用下，只有CD45RO+T细胞发生迁移，趋化指数>2。百日咳毒素预处理的细胞对颗粒溶素不再有反应，不发生移行，此效应途径涉及G蛋白偶连受体。实验中我们还发现了，颗粒溶素对B细胞无明显的趋化作用（本文未给出）。本研究提示了，颗粒溶素不仅具有细胞毒作用，而且具有化学趋化作用。颗粒溶素在10~100 μmol 发挥细胞毒活性而在相对较低的浓度下发挥趋化作用。意义在于，在不同的浓度梯度下，颗粒溶素可作为化学趋化物趋化免疫细胞到达损伤或感染部位，进一步扩大了免疫效应。总之，我们的研究显示颗粒溶素在炎症的不同阶段对其起作用，包括招募炎性细胞，激活促炎症反应介质的分泌；高浓度的颗粒溶素能直接杀伤细胞。然而，这些效应在不同浓度发生；在纳摩尔浓度下，颗粒溶素引起趋化现象且激活单核细胞产生许多促炎症反应分子；在微摩尔浓度下，颗粒溶素可溶解微生物和哺乳动物细胞。因此，在颗粒溶素胞吐的局部，高浓度的颗粒溶素和其他溶细胞分子共存，比如穿孔素和颗粒酶，都能溶解细胞；在离颗粒释放的部位较远的地方，颗粒溶素的浓度相对较低，发挥诱导和激活另外的免疫细胞。
【】
/[1/] Gamen S,Hanson D A,Kaspar A,et al.Granulysin?induced apoptosi I. Involvement of at least two distinct pathways/[J/]. J Immunol,1998,161:1758-1764.
/[2/] Hanson D A, Kaspar A A,Poulain F R,et al.Biosynthesis of granulysin,a novel cytolytic molecule/[J/]. Mol Immunol,1999,36:413.
/[3/] Kaspar A A, Okada S, Kumar J,et al.2001.A distinct pathway of cell?mediated apoptosis initiated by granulysin/[J/].J Immunol,2001,167:350-356.
/[4/] 钱 琤,陈孙孝,吴传勇,等.颗粒溶素ELISA检测方法的建立及临床初步应用/[J/].中华检验医学杂志,2006,29(11):1018-1019.
/[5/] 钱 琤,陈 波,陈孙孝,等.定量RT?PCR检测PBC患者外周血中颗粒溶素的基因表达水平/[J/].实验诊断学,2006,10(10):171-174.
/[6/] Sunxiao Chen,Hai Wen, Anmei Deng.Granulysin Is a Multifunctional Modulator of Innate Immune Response/[J/].Clinical and Investigative Medicine Journal,2004,27(4):113.
