重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究
作者：娄加陶，周晔，吴传勇，陈燕，蒋天舒，陈波，谷明莉，仲人前，邓安梅
【摘要】 目的 探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫应答的能力，为新型结核疫苗的设计打下基础。方法 通过细胞增殖和细胞毒性实验，研究纯化的重组表达多表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性，初步鉴定重组多表位肽的免疫原性。结果 以刺激系数（SI）＞3为界，多表位肽 （10 μmol） 能刺激全部10例HLA?A*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖，SI为46.2±5.6；增殖反应明显高于单肽（平均SI为10.2±2.3）以及PPD（平均SI为15.6±3.6）引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在多表位肽诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽（10 μmol）的T2细胞作为靶细胞，多表位肽诱导的CTL作为效应细胞，多表位肽能诱导全部的10例A2+ PPD+健康个体中CTL杀伤活性，平均活性分别为(86.2±9.6%)，显著高于单肽/[平均为（25.4±3.6）%/]和PPD/[平均为(22.6±2.8)%/](P<0.01)。结论 重组优化多表位肽在细胞水平具有较好的免疫原性，能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性。
【关键词】 结核分枝杆菌；多表位肽；疫苗
抗结核病的保护性免疫机制目前仍不清楚，但细胞免疫尤其是循环及感染部位的T细胞应答被认为起着重要作用。CD8+T细胞在抗结核感染中起着重要而独特的作用，尤其是近来AIDS和肺结核的重叠感染频率增加，因此设计以CTL表位为基础，诱导机体产生保护性CTL免疫应答，从而预防和肺结核的疫苗越来越受到重视。但实践证明单纯利用CTL表位制成的肽疫苗或DNA疫苗，特异性CTL免疫应答的水平一般较低，效果都不甚理想。为
了获得高效而特异的保护性CTL免疫应答，需要对单纯的CTL表位疫苗进行新的设计和改造。我们设计了含有可引导表位肽进入抗原提呈细胞的“木马肽”序列以及PADRE泛Th表位，并采用了高尔基体内固有肽酶furin识别序列作为表位接头的“串珠式”多表位肽M6[1]。有研究表明，PPD+健康个体作为潜伏性结核分枝杆菌感染者，体内持续存在的抗原引起相应的免疫应答而产生的大量抗原特异性T细胞是机体免疫性保护作用的基础。因此其PBMC对结核分枝杆菌抗原的应答，可作为研究抗结核分枝杆菌保护性免疫的良好模型[2~5]。这样便可以采用PPD+健康个体的PBMC对候选表位或抗原的免疫反应性来验证其免疫原性。本研究探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发CTL免疫应答的能力，为新型结核疫苗的设计提供良好的方案、奠定良好的基础。
1 材料与方法
1.1 研究对象
10例HLA?A*0201阳性健康志愿者，6例HLA?A*0201阴性健康志愿者，均为PPD+。留取外周血20 ml，肝素抗凝。
1.2 试剂和试剂盒
LPS、人重组IL?2、PPD、人重组GM?CSF、人重组IL-4购自R&D公司；FITC标记的抗?CD3、抗?CD8、抗?HLA.A2流式单克隆抗体均为Caltag公司产品； HLA?A2高分辨SSP?PCR试剂盒购自One Lamda公司；时间分辨荧光DELFIA细胞增殖（AD0200）与细胞毒性（AD0016）检测试剂盒均购自Wallac Oy公司；Ag85A(242~250 aa.KLIANNTRV)由上海生工生物工程技术有限公司合成；T2细胞株由上海长征临床实验诊断科保存。
1.3 HLA分型
先以鼠抗人HLA?A2单克隆抗体（BB7.2）进行HLA?A2流式细胞仪初步筛选，然后再以HLA?A2高分辨SSP?PCR试剂盒进一步确认其A*0201亚型。
1.4 抗原肽诱导CTL制备
用密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞，种于6孔细胞培养板，在含10%FCS的RPMI1640培养基中，37 ℃ 5%CO2孵育1.5 h。收集悬浮细胞，以10%二甲亚砜90%小牛血清保存于液氮备用。贴壁细胞为抗原提呈细胞－树突状细胞(DC)前体细胞，补充含GM?CSF(1 000 U/ml)，IL?4(1 000 U/ml)及含10%FCS的RPMI1640培养液，37 ℃ 5%CO2培养7 d 促其转化，需要时补充新鲜培养液。5 d 后，加入LPS(1 mg/L)培养2 d 后促进DC成熟，γ照射使其失去增殖活性。将经过照射的DC分别与抗原肽、多表位肽、PPD(10 μmol/L)在培养液中，37 ℃ 5%CO2共孵过夜。分别将1×105负载的DC与1×106自体PBMC种于含10%FCS的RPMI1 640完全培养液的24孔细胞培养板，37 ℃ 5%CO2混合培养3 d 后，加入rIL?2(20 U/ml)继续培养10 d，进行细胞增殖实验和细胞活性检测。
1.5 细胞增殖实验
细胞增殖实验采用时间分辨荧光DELFIA细胞增殖检测试剂盒。分别将经辐射的5×103负载的APC100 μl 与5×104抗原诱导的自体CTL100 μl 种植于96孔细胞培养板中（以空载的APC作为阴性对照），与20 μl BrdU应用液共孵10 h，离心洗1遍，加入Eu标记的抗BrdU单抗室温孵育2 h，洗涤、固定后，经时间分辨荧光检测仪测定荧光强度值。每个样本设立3个复孔，取其平均值为检测结果。增殖系数（SI）=含抗原肽的平均荧光强度值/阴性对照平均荧光强度值，将SI＞2的抗原肽视为能诱导淋巴细胞增殖。
1.6 细胞毒性分析
以抗原肽诱导CTL为效应细胞(E)，负载抗原肽的T2细胞作为靶细胞(T)，采用时间分辨荧光DELFIA细胞毒性试验测其杀伤活性。参照说明书进行操作，共培养4h，最后检测样本荧光值。每个样本设立3个复孔，取其平均值为检测结果。细胞杀伤活性（%）=（待测孔荧光强度值-释放孔荧光值）/（最大释放孔荧光强度值-自然释放孔荧光值）×100。
1.7 统计分析
统计处理采用SAS 6.12 软件，用t检验分析计量资料，P＜0.01认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 抗原肽刺激细胞增殖实验结果
以细胞增殖反应评价多表位肽M6诱导PBMC中抗原特异性CTL应答水平。结果表明，10例HLA?A*0201阳性的PPD+健康人群PBMC对多肽M6、Ag85A(242?250 aa)及PPD均产生不同程度的阳性增殖反应， SI分别为46.2±5.6、10.2±1.3、15.6±3.6，统计分析P<0.01，而在HLA?A*0201阴性PPD+健康对照组M6及PPD也产生不同程度的阳性增殖反应， SI分别为12.86±2.2，12.1±2.6，Ag85A(242?250aa)未出现显著的增殖反应（如图1所示）。
2.2 抗原肽诱导的 CTL杀伤毒性
HLA?A*0201阳性PPD+健康者PBMC对M6，Ag85A(242?250aa)及PPD均表现出不同程度的杀伤活性，分别为（86.2±9.6）%，（25.4±3.6）%，（22.6±2.8）%，统计分析P<0.01。而在HLA?A*0201阴性PPD+健康对照组中，PBMC对M6及PPD均表现出不同程度的杀伤活性，分别为（18.47±2.3）%，（27.89±3.7）%，而Ag85A(242?250aa)杀伤活性<10.0%（如图2所示）。
3 讨论
CTL在控制细胞内病原菌感染和肿瘤中有着重要的作用，其中TCR?肽?MHC复合物是启动免疫应答的关键，设计有效激发CTL免疫应答的疫苗，可用于预防和感染和肿瘤等疾病。CD8+T细胞免疫应答过程中，胞内蛋白被降解成多肽，由TAP复合体转运至内质网，进一步被修饰为适合MHC分子结合的8~10 aa 片段并结合转运至胞外与TCR结合[6]。因此CTL表位形成需要抗原能进入胞内发生蛋白降解过程，胞内合成的蛋白易于被蛋白酶降解，而绝大多数外源性蛋白则不能。所以由蛋白质组成的疫苗通常能有效激发较强的抗体和Th免疫应答，而诱发CTL应答能力较弱。为了获得高效而特异的保护性CTL免疫应答，我们对单纯的CTL表位疫苗进行三方面的改造：（1）引入来源于HIV?I Tat 的木马肽（Trojan peptide，TA）序列( carrier)作为“向导序列”加速目的抗原的降解及提呈。TA可以转运含有T细胞表位的多肽至APC胞内，形成能被CTL识别的细胞表面肽/MHC复合物[7~8]。（2）引入广谱高效的Th表位PADRE(Poly Alamine DR Epitope)来改善Th细胞的功能状态，以达到增强特异性CTL免疫应答。（3）采用高尔基体固有肽酶furin识别基序作为表位间的接头，furin参与分泌途径中TAP非依赖性CTL表位处理，识别RX(R/K)R基序[9]。从而保证各表位有效的释放和递呈。采用TA技术比重组病毒、质粒或蛋白更为简单。该技术是通过转运肽结构直接进入APC，以TAP非依赖机制形成CTL表位。在分泌途径中，高尔基体固有肽酶furin已经其他氨基肽酶参与TA引导表位肽的处理。因此TA技术在研发CTL疫苗，不仅在直接体内免疫还是体外致敏DC的细胞疫苗都有着广阔的运用前景。本研究对表达的多表位肽M6激发CTL免疫应答水平进行初步验证，发现M6可明显增强CTL免疫应答水平，为新型抗结核疫苗的研发和设计奠定了基础。
【】
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