缺氧对大鼠成骨细胞增殖及凋亡的影响

                作者：顾九君，刘兴炎，盛俊东，白孟海，葛宝丰

【摘要】  目的 探讨缺氧对体外培养成骨细胞增殖及凋亡的影响。方法 应用MTT法、丫啶橙检测缺氧对体外培养成骨细胞的增殖及凋亡的影响。结果 缺氧抑制了成骨细胞的增殖，且提高了成骨细胞的凋亡率，上述改变随着缺氧时间的延长而更加明显。结论 缺氧具有抑制体外培养成骨细胞增殖，促进成骨细胞凋亡的作用。

【关键词】  缺氧；成骨细胞：细胞增殖；细胞凋亡

    骨折的基本危险因素之一是骨质疏松。最近，动物实验、流行病学和临床研究表明骨质疏松与血管损伤有关[1~5]。有研究[6]指出，骨血流与骨塑形密切相关。研究发现，在股骨颈骨折患者的股骨头上，小动脉或毛细血管的数量显著减少[7]。在末端低血流的妇女中，跟骨的骨量丢失高达大约30%[8]。然而，对于上述发现的准确机制仍不清楚。在血管病理生中，缺氧是一个重要的因素，它可能会引起成骨细胞生物学行为的变化。因此，本实验通过研究缺氧对成骨细胞增殖及凋亡的影响，旨在探讨缺氧促进骨质疏松形成的作用机制。

　　1  材料与方法

    1?1  细胞培养

    1．1?1  成骨细胞的原代培养

　　取新生(出生24 h 以内)Wistar大鼠(兰州大学医学部动物实验中心提供)，将乳鼠放入75%乙醇中消毒，断颈处死，无菌取头盖骨，剔除黏附的结缔组织和血管，将头盖骨切碎，经0.25%胰蛋白酶消化20 min，每3 min 振荡1次，弃去消化液。以0．1%Ⅱ型胶原酶在37 ℃ 消化60 min，每3 min 振荡1次，重复2次，消化液离心1 000 r/min，10 min；收集细胞，接种于含10%胎牛血清的a?MEM培养液中培养，培养瓶置37 ℃ 培养箱，24 h 换液。

    1?1?2  培养细胞的鉴定 

　　(1)成骨细胞的形态观察。(2)成骨细胞的碱性磷酸酶染色[5]：细胞固定后入基质液(含2 g/L a?萘基磷酸钠、2 g/L 坚牢蓝RR盐)，于37 ℃ 孵育15 min，出现紫蓝色斑点后，弃基质液，流水冲洗，乙醇脱水，镜下观察摄像。(3)矿化结节染色：细胞固定后，用0．1%茜素红(alizarin red?S)染色30 min，蒸馏水洗3次，乙醇脱水，镜下观察摄像。
   
　　1．2  缺氧条件下培养成骨细胞
   
　　1?2．1  缺氧装置的构建[9]  

　　以橡皮塞密封培养瓶口，在橡皮塞上插入两个9#针头分别作为进气、排气孔，高纯氮气通过装有二蒸水的已经高压灭菌处理的大烧瓶过滤后，经胶皮管与进气孔针头相连接，以1 L/min 的流量持续充入5 min，随机从出气孔抽气进行血气分析，控制氧分压为2．5 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，密封。
   
　　1?2．2  缺氧培养方案 

　　取6瓶第2代细胞，分为A，B，C，（通讯作者：刘兴炎教授、博导，E-mail：）D，E，F 6组。更换无血清培养基，应用上述装置将A，B，C，D，E，F分为常氧组、缺氧1，2，3，4和5 d 组，然后转入常氧培养，根据检测指标决定培养时间。

    1．3  成骨细胞增殖率测定     

　　将干预后的细胞用0．25%胰蛋白酶液和0．02%EDTA消化收集细胞，调节细胞浓度为1×104/ml，于96孔板每孔加0．2 ml，同时设空白对照组，只加入培养基。37 ℃ 培养24 h 后，弃取培养液，PBS洗1次，每孔加含10 ml MTT的a?MEM培养液，继续培养4 h。弃去培养液，每孔加DMS0 100 ml，震荡，在酶联免疫检测仪上选择570 nm 波长，测每孔的光密度值(OD值)。

    1．4  成骨细胞凋亡的丫啶橙染色 

　　（1）丫啶橙液的配制： 10 mg丫啶橙溶于100PBS中， pH值4．8~6．0滤过， 4 ℃ 保存。 （2）将干预后的细胞培养满5 d，  吸去培养液， 0．25%胰蛋白酶液消化， 去消化液， 含10%小牛血清的a?MEM终止消化， 反复吹打后细胞悬液移入离心管，1 000 r/min×5 min 离心，加入0．1M PBS液使细胞浓度为107/ml，取95 μl 的丫啶橙溶混匀，吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片：荧光显微镜选用激发滤片BG12，阻断滤片用515 nm，镜下观察。（3）结果判断：荧光显微镜下，细胞核DNA为黄色荧光，细胞质和核仁的RNA为橘黄或桔红色荧光。出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片。荧光显微镜下计数100个成骨细胞中凋亡细胞百分比。
   
　　1．5  统计学分析 

　　用SPSS9．0软件对实验结果进行分析，数据以平均数±标准差表示，组间比较采用t检验。

　　2  结果

　　2?1  成骨细胞的形态观察 

　　在倒置显微镜下可见成骨细胞传代12 h 后，细胞贴壁生长，外观呈梭形、三角形或鳞片形，以梭形细胞居多。培养第3天可见细胞形态仍以长梭形居多，细胞形态较接种初期稍显饱满，至培养第5天细胞增殖至基本覆盖培养皿底；至培养第7天细胞完全覆盖皿底，且有细胞团块出现。
   
　　2?2  成骨细胞的碱性磷酸酶染色     

　　细胞胞浆内有紫蓝色沉淀并掩盖于细胞核上，染色呈强阳性。
 
　　2?3  矿化结节染色 

　　经过25 d 的培养，成骨细胞形成圆形矿化结节，橘红色，边界清晰。

　　实验结果表明，经过缺氧干预后，缺氧组的细胞增殖受到抑制，缺氧1 d，2 d，3 d，4 d，5 d 时的OD值明显低于正常氧组，各组与对照组比较差异有统计学意义(P<0．05)，各缺氧组之间差异亦有统计学意义(P<0．05)。详见表1。表1  缺氧不同时间对成骨细胞增殖的影响（略）

　　2?5  面骨细胞凋亡的丫啶橙染色 

　　正常氧组成骨细胞形态结构正常，细胞呈圆形或椭圆形，细胞核内染色质均匀分布，缺氧组成骨细胞核内出现黄绿色致密浓染团块，细胞内可见凋亡小体。随着缺氧时间的延长，凋亡细胞逐渐增多，多表现为核异形、核浓缩、核碎裂。本研究表明，缺氧可加速成骨细胞凋亡，且随缺氧时间的延长，成骨细胞凋亡率逐渐增加，各缺氧组细胞的凋亡率均显著高于正常氧组(P<0．01)，而且，各缺氧组之间(除缺氧4 d 组与5 d 组之间)差异亦有统计学意义(P<0．05)。详见表2。表2  缺氧不同时间对成骨细胞凋亡率的影响（略）

　　3  讨论

　　成骨细胞体外实验显示，成骨样细胞在分化过程中能从增殖活跃细胞分化为周围有矿化骨基质的成熟成骨细胞。成骨细胞分化为三个阶段：细胞增殖、骨基质成熟与骨基质矿化阶段[10~11]。其中，在骨基质成熟期，ALP基因的表达达到最高峰，ALP活性最高，表明骨基质的成熟。骨基质矿化阶段，ALP活性逐渐下降，BGP基因的表达明显增强，细胞有多个骨结节形成。ALP的合成与矿化结节的形成是成骨细胞的表型特征，也是细胞鉴定的主要依据。本试验采用胶原酶法获得大鼠的成骨细胞，进行细胞形态、碱性磷酸酶染色和矿化结节染色鉴定，结果显示培养的细胞具有成骨细胞的表型特征，符合研究的需要。

　　减少伴有骨强度的降低，主要与骨吸收和骨形成的动态平衡破坏有关。而骨形成和吸收主要由成骨细胞和破骨细胞来完成。骨形成取决于成骨细胞的数量及其活性。成骨细胞一定数量的增殖，才能产生丰富的骨胶原和分泌钙离子，并通过钙化形成骨细胞，以维持骨组织生理代谢。本实验使用MTT比色法测定成骨细胞增殖功能，结果表明缺氧明显抑制成骨细胞的增殖，并且随着缺氧时间的延长，增殖能力显著下降。这与Steinbrech等[12]证明的缺氧抑制成骨细胞的结论相似。骨形成取决于成骨细胞的数量与活性，缺氧通过抑制成骨细胞的增殖，导致了骨形成能力的下降。成骨细胞凋亡在骨的转化中起重要的作用，Jilka等[13]认为成骨细胞在完成骨形成以后一部分包于骨基质中，另一部分成为骨细胞或成为衬细胞位于骨表面50%~70%的成骨细胞则以凋亡的形式死亡。成骨细胞异常凋亡可能是骨质疏松症的发病机制之一。weinstein等[14]对7月龄大鼠用泼尼松注射，27 d 后检测发现锥体成骨细胞凋亡较正常升高3倍，干骺处皮质骨有28%的骨细胞发生凋亡。Silvestrini等[15]对大鼠注射肾上腺酮(10 mg/d)诱导骨质疏松，然后研究发现，成骨细胞凋亡显著增加。2007年4月 第35卷 第2期临  床 军 医 杂 志 (Clin J Med Offic)在细胞凋亡过程中，由于胞浆和染色质浓缩，核裂解，凋亡小体形成，使细胞的光散射性质及DNA含量的荧光强度发生变化。本试验分别用丫啶橙染色正常培养组与缺氧1 d，2 d，3 d，4 d，5 d 的成骨细胞，各组的凋亡率。研究结果发现，在正常氧情况下，体外培养的成骨细胞凋亡率较低，远低于5%，这与Tumber等[16]的研究结果相同；缺氧各组的成骨细胞凋亡率显著增高，远高于5%。这充分说明，缺氧能够提高成骨细胞的凋亡率。从缺氧各组之间的比较发现，随着缺氧时间的延长，成骨细胞的凋亡率逐渐升高，各组之间的差异亦具有统计学意义。这进一步证明：缺氧对成骨细胞凋亡的促进作用是随着缺氧时间的延长而逐渐加强的。成骨细胞的数量及成骨活性对维持骨的代谢平衡非常重要，一旦这种平衡被破坏，就可能引起骨代谢障碍。成骨细胞的数量取决于细胞凋亡与细胞增殖的平衡，这种平衡的丧失，必将导致各种代谢性骨病的发生。本试验充分表明，缺氧抑制了成骨细胞的增殖，而且促进成骨细胞的凋亡，从而导致了成骨细胞的数量及成骨活性的明显下降，最终使骨质疏松的发病率明显升高。本试验的研究结果初步揭示了缺氧导致骨质疏松发生的作用机制，为有效的预防及本病提供了试验依据。

【】
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