结核分枝杆菌Rv0309抗原的重组表达、纯化和鉴定
作者：蒋天舒，娄加陶，周晔，陈燕，陈波，谷明莉，仲人前，邓安梅
【摘要】 目的 重组表达结核分枝杆菌Rv0309蛋白，以进一步探讨其免疫效应。方法 将结核分枝杆菌抗原Rv0309的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX?4T?1中，构建成Rv0309重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达，进一步经GST亲合层析柱纯化，经SDS?PAGE和Western?blot鉴定重组表达蛋白。结果 获得了pGEX4T?Rv0309重组子，并在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组Rv0309蛋白，其条带大小约23 000，与预期结果相符。结论 成功地进行了结核分枝杆菌抗原Rv0309的基因克隆与重组表达，为进一步研制新型结核病疫苗打下了基础。
【关键词】 结核分枝杆菌；Rv0309抗原；重组表达；纯化
结核病(tuberculosis，TB)是全球主要传染性疾病之一，严重危害人类健康，同艾滋病、疟疾并列为世界三大疾病。全世界约有20亿人口感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)，每年新发病约800万，死亡约200万[1]。近年来，结核分枝杆菌多重耐药菌株不断增加，全球化产生人口大规模流动，使结核病的发病率和死亡率呈上升趋势。卡介苗(BCG)是目前唯一可用的抗结核疫苗。研究表明，BCG可预防儿童结核性脑病，但在不同的人群和地域中其保护力差异很大，并且对结核病主要流行和传播形式的成人结核病，预防效果不佳[2]。因此，研发新型结核疫苗以替代卡介苗势在必行，选择理想的候选抗原对于研制有效的疫苗至关重要。
国外有研究采用基因芯片技术和生物信息学分析，从Mtb基因组中筛选出多种可能的高表达、分泌型蛋白或（和）脂蛋白，其中包括Mtb中高度保守的脂蛋白Rv0309。本研究在此基础上，对Rv0309进行重组表达，以进一步研究其免疫原性，为新型结核疫苗的研制打基础。
1 材料与方法
1．1 质粒、血清与菌株 质粒pGEX4T购自Am Phamacia公司，美国。
结核病血清来源于本院住院病人。大肠埃希菌BL21均为本实验室保存。
1．2 PCR引物设计与合成
参照结核分枝杆菌H37Rv0309的全序列，设计上下游引物。上游引物为5’GCTGGATCCGGCTTGCCGGTGAGATA?3’，下游引物为5’?GCACTCGAGACGGCGGCGTTGGCGACGTTT?3’，在上、下游引物5’端分别引入BamH I、Xho I 酶切位点和保护碱基，以便于酶切和克隆。
1．3 工具酶和主要试剂
限制性内切酶BamH I、Xho I购自Takara公司；T4DNA连接酶购自Roche公司；Taq酶、IPTG购自上海博光生物科技有限公司；辣根过氧化物酶购自Dako公司。DNA凝胶回收试剂盒购于Oxoid公司。
1．4 Rv0309抗原编码区的扩增
结核分枝杆菌H37Rv株接种Sauton培养基于37 ℃ 培养7周，DNA的提取和纯化参照[3]的方法。以人结核分枝杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增反应。反应总体系为50 μl，含ddH2030．0 μl，10×PCR缓冲液5．0 μl，dNTPs 4．0 μl，模板1．0 μl，特异性引物对各2．0 μl (40 umol/L)，Taq酶1．0 μl。反应条件为：PCR扩增反应条件为94 ℃ 变性1 min，56 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，35个循环后再进行72 ℃ 延伸5 min。
1．5 PCR产物的克隆及重组转化子的鉴定
回收Rv0309抗原序列的PCR产物，以BamH I、Xho I 双酶切，然后与经同样酶切的pGEX4T载体连接，转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，挑取转化子进行测序。
1．6 Rv0309蛋白的表达及纯化
挑取转化平皿上的菌落，接种于LB培养液中，37 ℃ 摇床培养扩增至A600为0．4左右加入终浓度为0．1 g/L 的异丙基硫代?β?D?半乳糖苷(IPTG)，诱导表达4 h，4 ℃ 离心收集菌液。将菌液反复冻融4次，经超声破碎仪以300 W，15 s，破碎4次，以上操作在冰浴中进行。而后在4 ℃，10 000 ×g离心15 min，收集沉淀，以含0．5%TritonX?100，10 mmol/L EDTA的缓冲液洗涤后，用100 μl 裂解缓冲液(含0．1 mmol/LPMSF，8 mol/L 尿素，10 mmol/L DTT)溶解包涵体，室温放置1 h。将100 μl 变性蛋白溶液加入到3 ml 的稀释变性液中，再装入透析袋中放入5 L 的复性液中4 ℃ 搅拌透析过夜。取出透析袋中的液体流经PBS平衡后的GST亲合层析柱，经20 ml PBS洗涤后，用5 mmol/L 还原型谷胱甘肽溶液洗脱，收集洗脱液，进行15%十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺胶电泳(SDS?PAGE)分析。
1．7 Rv0309基因表达蛋白的鉴定
将上述收获的经诱导表达pGEX4T?Rv0309表达的菌体蛋白、空载体表达的菌体蛋白及纯化后的GST?Rv0309进行SDS?PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜上，用5%脱脂奶粉封闭过夜，将结核病患者血清以1：100稀释作为一抗，以HRP标记的羊抗人IgG作为二抗，室温作用1h，加入底物联苯氨显色，出现棕色条带后，2 mol/L 的硫酸终止显色。
2 结果
2．1 pGEX4T?Rv0309重组子的获得
从转化后的重组子中挑取的重组克隆经BamH I，Xho I 双酶切后，取5 μl PCR产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，可见一条清晰特异扩增条带，大小约为654 bp，与理论预计值基本一致(图1)。测序表明，PCR扩增的结核分枝杆菌Rv0309 cDNA序列经上海生工生物工程技术有限公司测序，结果完全符合预期要求。
2．2 Rv0309基因在BL21菌株中的表达及纯化
将含有pGEX4T?Rv0309质粒的大肠埃希菌BL2l菌经IPTG诱导表达，进行15%SDS?PAGE蛋白电泳，发现在相对分子质量约为23 000处，与未经IPTG诱导菌株相比，有一条明显蛋白条带，同预计的大小一致(图2)。将菌体蛋白超声后的上清用亲和层析的方法纯化后获得了一条单一的蛋白条带，大小为45 000 左右，与预期的结果相一致。
2．3 Western?blot印迹
用结核病人血清作为捕获抗体对表达及纯化的蛋白进行鉴定。结果表明在与蛋白电泳相对应的23 000 处有一特异的棕色条带，而空载体表达的GST蛋白对应泳道无条带出现，表明该条带是Rv030C蛋白特异性结合患者血清而产生的条带。而不是GST蛋白结合产生的；亲和层析后纯化的蛋白也可被血清所识别，上述结果表明GST?Rv0309蛋白在纯化前后均保持了的免疫原性。
3 讨论
据世界卫生组织统计表明，结核病仍然是全球人类健康的威胁。虽然卡介苗一直广泛应用于结核病的预防，但不少报道其预防作用极不稳定，尤其是对艾滋病等免疫功能受损的患者接种后可能导致严重播散性结核病，因此，安全、高效的新型结核病疫苗势在必行[4~6]。Rv0309是一种高度保守的应激蛋白，在结核分枝杆菌感染过程中，Rv0309是机体对其入侵的最重要的免疫保护性抗原之一[7]。结核分枝杆菌生长期分泌的蛋白对结核病的保护性免疫是很重要的。人们普遍认为细胞外蛋白(分泌型的或与细胞壁蛋白有关的蛋白)是保护性免疫应答反应所识别的主要抗原成分。结核分枝杆菌分泌蛋白被认为是主要免疫原性抗原，并被作为制备疫苗的靶抗原。Rv0309是结核分枝杆菌的一种主要分泌蛋白，因此，我们对其进行重组表达，以进一步研究其免疫原性，为疫苗的研制打下了基础。
本研究选用大肠埃希菌融合表达系统进行表达及纯化结核分枝杆菌的Rv0309抗原。选用该系统主要由于下列原因： (1)结核分枝杆菌和大肠埃希菌比较接近，都属于原核生物； (2)从大肠埃希菌中纯化Rv0309蛋白操作简单，费用相对便宜且表达量较高。本实验选用大肠埃希菌表达系统并选择pGEX?4T载体进行表达，表达量较高。pGEX?4T?1载体是常用的融合表达载体，目的基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因融合表达，有利于蛋白的稳定和纯化，它还具有专一性蛋白酶识别位点，可以从表达的融合蛋白中切下所需要的蛋白和多肽[8]。表达菌株BL21(DE3)可以高效表达克隆于含有tac启动子的表达载体(如pGEX?4T?1)的外源基因，它还以蛋白酶缺陷而著称，因此能够产生更多的全长融合蛋白。本研究构建了高效表达Rv0309的大肠埃希菌菌株，高纯度的重组Rv0309成熟蛋白的获得，有助于了解RV0309在诱导宿主产生保护性免疫应答中的作用，对进一步利用该抗原制备疫苗进行结核病的防治研究打下了基础。
【文献】
/[1/] Chan E D,Iseman M D.Current medical treatment for tuberculosis/[J/].BMJ,2002,325(30):1282-1286.
/[2/] Berthet F X, Rasmussen P B,Rosenkrands I,et al. A mycobacterlum tubemdosis operon encoding ESASr’6 and a noval low.Culture filtrate protein/[J/].Microbiology,1998,114(Ptll):3159-3203.
/[3/] Fu F,Li Y,Qian S,et al.Costimulatory molecule2deficientdendritic cell progenitors(MHC class Ⅱ+,CD80dim,CD862)prolong cardiac allograft survival in nonimmuno supp ressedrecip ients/[J/].T ransp lantation,1996:62(5):659.
/[4/] Brandt L,Feinocunlm J,Weinreicholsen A,et al.Failure of the mycobactefium bovis BCG vaccine:some species of enviammental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of proteetive immunity to tuberculosis/[J/].Infect Immun,2002,70(2):672.
/[5/] 范雄林,徐志凯,李 元,等.结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究/[J/].细胞与分子免疫学杂志,2003,19(1):90.
/[6/] Rikke L, Vinther S,Thomas O,et al.Comparative evaluation of low?molecular?mass protein from mycobactefium tuberculosis identifies members of the ESAT?6 family as immunodominant T?cell antisens/[J/].Infect Immun,2000,68(1):214.
/[7/] Vani M S,Shaila N R,Chandrab B,et al.A combined immuno?informatics and structure?basedmodeling approach for prediction of T cell epitopes of secretory proteins of mycobacterium tuberculosis/[J/].Microb Infect,2006,8:738-746.
/[8/] 吴传勇,娄加陶,蒋廷旺,等.结核杆菌抗原多表位融合蛋白的重组表达与鉴定/[J/].第二军医大学学报,2006,27(12):1281.
