雌激素对穹隆海马伞切断大鼠脑内nAchR的干预作用
作者：张延霞，郭宗君，崔瑞耀，骆刚
【摘要】 目的 以双侧穹隆?海马伞切断制作阿尔茨海默病（AD）大鼠模型，观察脑内海马CA1区和皮层区烟碱型乙酰胆碱受体（nAchR）表达的变化，探讨与 AD相关的发病机制，并观察雌激素的干预作用。方法 健康雌性Wistar大鼠，随机分为3组：（1）穹隆?海马伞切断组；（2）雌激素组；（3）假手术对照组；每组大鼠5只。在脑立体定位仪上切断穹隆?海马伞，建立模拟AD动物模型。应用免疫组织化学技术观察AD大鼠海马CA1区和皮层区的nAchR阳性细胞表达的变化，以及应用外源性雌激素的干预作用。结果 与对照组大鼠脑内nAchR表达比较，穹隆?海马伞切断组大鼠脑内海马CA1区、皮层区nAchR表达显著减少（P＜0．05）；与穹隆?海马伞切断组比较，雌激素治疗组海马CA1 区、皮层区nAchR表达显著增加（P＜0．01），但与对照组比较无显著差异（P＞0．05）。结论 穹隆?海马伞切断组大鼠脑内海马CA1区、皮层区nAchR的阳性细胞显著减少，补充外源性雌激素治疗后，上述各脑区内的nAchR表达显著增加。nAchR的变化与AD的病理变化过程密切相关，补充雌激素可以干预这种病理过程。
【关键词】 穹隆?海马伞切断；烟碱型乙酰胆碱受体；雌激素；阿尔茨海默病
Abstract： Objective To observe the expression of nicotinic acetylcholine receptor (nAchR) in the brain's fimbria/fornix transected rats, the effect of ectogenic estrogen on it, and its relation with Alzhelmer's disease (AD). Methods Healthy female Wistar rats were divided into three groups at random: (1) fimbria/fornix transection group, (2) estrogen treatment group, and (3) control group. There were five rats in every group. And their fimbria/fornix was transected in order that AD models were made. Immunoreactive cells with nAchR were stained by immunohistochemical way so that the expression varieties of nAchR immunoreactive cells could be observed in hippocampus CA1 and cortex. Results In fimbria/fornix transection group, the expression of nAchR obviously decreased in the observed areas of the brain (P<0.05 ). In estrogen treatment group, the expression of nAchR increased remarkably (P<0.01 ). Conclusion The cells expressing nAchR clearly decrease in the areas of CA1 and cortex of rats when their fimbria/fornix is transected, but the cell number increases significanly if ectogenic estrogen is added. The change in nAchR is closely relative with AD whose pathological course can be influenced by the intervention of estrogen.
Key words： fimbria?fornix; transection; nicotinic acetylcholine receptor; estrogen; Alzhelmer's disease
阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）是一种以认知记忆障碍为主要特征的进行性神经系统疾病。其特征性病理改变为老年斑，神经元纤维缠结及神经元丢失以及多种神经递质和受体的改变。AD是神经系统进行性退行性疾病，其病因可能是多源性的，其中，乙酰胆碱受体与AD发病有密切的关系[1]。研究表明，雌激素与AD有密切关系[2]。本实验利用穹隆?海马伞切断的方法模拟制作AD大鼠模型，观察AD发生时和给予外源性雌激素（E2）时，大鼠脑内海马CA1区和皮层区烟碱型乙酰胆碱受体nAchR表达的改变，进一步研究E2与nAchR的关系以及作用机制，从而为临床E2治疗AD提供理论基础。
1 材料和方法
1．1 实验动物和分组
健康雌性Wistar大鼠，由山东大学医学院动物中心提供，5月龄，体质量220~250 g。随机分成三组：(1）穹隆?海马伞切断组；(2）雌激素治疗组；（3）假手术对照组；每组5只大鼠。
1．2 实验方法
1?2?1 模型制作
双侧穹隆?海马伞切断： 经10%水合氯醛（300 mg/kg，ip）麻醉后，将大鼠固定于江湾IC型脑立体定位仪，按常规消毒、剪毛、正中切开头皮，暴露出颅骨，参照Paxinos 和Watson的大鼠脑立体定位图谱与既往研究方法[3,4]。在前囟后2．2~2．5 mm，中线外1 mm 处，用电动开颅器凿开颅骨，切开硬脑膜，用自制双刃刀先置于上述部位的脑表面，接着降刀 4．5 mm，外移1 mm，然后再降刀1 mm，外移1．5 mm，最后上下抽动刀约20次，以保证海马伞外侧缘完全切断。清洁颅面，缝合头皮，常规饲养[5,6]。
1?2?2 动物灌注、固定、取材
模型大鼠经10%的水合氯醛腹腔麻醉，开胸，心脏灌洗，生理盐水250 ml，快速冲洗2 min，冲净血液后，4%的多聚甲醛灌注固定5~10 min 后，断头取脑，锯开颅盖骨，剪开硬脑膜，切下组织块放入4%的多聚甲醛后固定30~40 min，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
1?2?3 免疫组织化学染色检测（SABC法）
切片入nAchR抗体（1：200，博士德公司）孵育4 ℃ 过夜，或37 ℃ 孵育1 h，入生物素化兔二抗（中山公司）孵育2 h，入ABC复合物（中山公司）孵育2 h，上述每步之间均经0．01 mol/L PBS溶液漂洗3次，每次10 min。DAB呈色，脱水透明、封片，光镜观察。阴性对照：用0．01 mol/L PBS代替一抗，其余步骤相同。免疫组化阳性细胞计数：nAchR阳性细胞为胞浆内呈棕黄色颗粒，与背景对比度明显。在显微镜下，记录阳性细胞数量，并拍照。
1．3 雌激素补充疗法[7]
雌激素治疗组模型制作方法同穹隆?海马伞切断组，其后应用雌二醇E2（1 mg/kg），每7 d 给予皮下注射1次，共30 d。观察补充外源性雌激素对nAchR的干预作用。
1．4 实验数据与统计处理
在高倍镜下（400倍），海马CA1区和皮层区随机各取5个视野计数阳性细胞，平均单个视野中阳性细胞个数，用均数±标准差(±s)表示。各组数据间比较用计算机SPSS11．0软件做统计分析，然后两组数据间比较用t检验，P＜0．05为差别有显著统计学意义。
2 结果
对照组大鼠脑内海马CA1区、皮层区nAchR有基础水平的表达，平均细胞记数分别为62．67±2．52，111．67±7．51。穹隆?海马伞切断组上述各部位的nAchR阳性细胞数分别为33．00±8．19，31．33±7．57，与对照组比较，有显著性减少（P＜0．05）；雌激素组大鼠脑内nAchR的阳性细胞数为66．00±4．24，97．67±9．29，与模型组比较显著升高，与对照组比较,P＜0．05,与穹隆?海马伞切断组比较,P＜0．01差别有统计学意义（P＜0．01），与对照组比较，无显著性差异（P＞0．05）。详见表1，图1。表1 nAchR在各观察部位的表达定量分析（略）
3 讨论
实验证明，大、小鼠自出生后第1~30 d 内，卒中、中脑、海马等区的nAchR含量是随年龄增长而增加。其中出生15 d 后增加速度最快，此后随着动物的衰老，含量又逐渐减少，14个月时，大脑皮质的nAchR含量仅为出生1个月时的20%。这种生理调节不仅表现在nAchR数量的变化，很可能也存在有受体亚单位组合方式的改变[8]。因此，考虑AD时存在同样的改变，本实验利用穹隆?海马伞切断制作AD大鼠模型，观察到nAchR数量也明显下降。海马胆碱能系统的兴奋是学习、记忆、意识的基础。研究表明，乙酰胆碱（Ach）是直接执行学习行为的神经递质，它能使神经元持续兴奋，成串放电，并有利于记忆的贮存。胆碱能系统活性下降是引起AD的重要原因。神经生物化学研究显示AD患者胆碱乙酰转移酶（ChAT）、乙酰胆碱酯酶（AchE）活性下降，Ach的合成减少，且与痴呆的严重程度密切相关[9]。胆碱能活性下降与AD的老年斑和神经纤维缠结密切相关，二者形成恶性循环，加剧了AD的恶化。本实验采用穹隆?海马伞切断模拟大鼠AD模型[4,6]，造成胆碱能上行投射系统损害，致使海马、大脑皮质失胆碱能支配，发生胆碱能损害。可以认为nAchR数量的下降是其配体乙酰胆碱减少、活性下降，对nAchR的营养支持作用降低而形成的。Tau蛋白的异常磷酸化是神经纤维缠结的重要成因，并与Aβ一起共同导致神经元和突触退变、神经递质传导障碍、胆碱能系统活性低下、蛋白激酶C活性下降，引起蛋白激酶GSK 3活性上升，磷酸化tau蛋白增加，这种恶性循环选择性损害敏感区，Ach受体被破坏，nAchR水平降低，信息传导下降。神经营养因子受体（TrkA）与CHAT，雌激素受体（ER）有共存现象[10,11]。提示它们的配体（神经营养因子，雌激素）可能作用于同一神经元。本实验研究结果表明，穹窿?海马伞切断造成胆碱能纤维中断，海马、大脑皮质胆碱能神经元变性，ER，TrkA功能受体出现异常。NGF的神经营养作用，是胆碱能神经元生长、发育所必需的，AD时胆碱能神经元对NGF的敏感性下降，雌激素作用减弱，也是导致胆碱能神经元功能减退、nAchR水平降低的重要因素。SD大鼠的卵巢切除以后，其主动回避行为下降，应用Morris水迷宫实验表明，OVX大鼠虽然空间学习获得能力正常，但缺乏空间记忆力，补充雌激素明显改善上述异常，表明雌激素对人类及动物学习，记忆，认知功能的重要性。雌激素促进DA，5?HT，Ach等神经递质的合成。给OVX鼠注射雌激素后的6~12 h 内，大鼠的基底前脑核及其投射区某些神经元的ChAT水平增加，酶活性增加，而且有量效关系；雌激素拮抗剂能阻断此作用[12]。因此，认为雌激素能增加基底前脑胆碱乙酰基转移酶（CHAT）的水平，ChAT催化神经递质?乙酰胆碱的合成，提高乙酰胆碱的水平，刺激nAchR数目的增加和活性的恢复，本实验结果与此相符。雌激素可以保护由N?甲基?D?天冬氨酸（NMDA）介导的神经毒性作用，它是通过对NMDA受体活性的调节作用而实现的。在成熟的大鼠，给予雌激素替代治疗能提高基底前脑的胆碱能神经元的功能[13]。因此，雌激素可使神经元和受体的凋亡减少，胆碱能系统功能增强，nAchR数目升高。雌激素可通过神经内分泌免疫调节的平衡对中枢认知功能及与AD脑部病理变化的发生与有关的多个环节产生作用。因此AD的发生也可能与雌激素介导的神经内分泌免疫调节网络的平衡失调有密切关系[14]。AD时雌激素可能通过神经内分泌调节nAchR，使其数量上升。大脑中与学习和记忆力功能密切相关的海马CA1区域在动物卵巢切除后出现退行性改变，经雌激素替代治疗后，神经元结构恢复正常，突触密度随之增加。类似的现象在动物发情周期中也可见到，求偶前期（雌激素水平升高）神经元突起的数量增加，而在求偶期（雌激素水平下降）突起的数量明显下降。大鼠求偶期与求偶前期间隔只有72 h，表明雌激素与神经元突起数量密切相关，且其作用的产生速度相当快[15]。另外雌激素还能促进星状胶质细胞发育，支持神经元功能，对损伤的脑细胞有促进修复作用，从而使nAchR水平升高。通过以上研究可知，雌激素循环过程中的变化将会影响大鼠脑中基底前脑内的胆碱能神经元。这些神经元主要投射区域在皮层和海马，在学习和记忆过程中起非常重要的作用。穹隆?海马伞切断中止乙酰胆碱向海马和皮层的投射，可使脑内胆碱能神经元功能下降、胆碱能神经元退变或坏死，造成神经元的丢失，nAchR减少。给予雌激素替代治疗能显著提高胆碱能神经元的功能，包括能明显提高nAchR在脑内的表达，与雌激素防治老年性痴呆等认知障碍疾病的重要作用有关，雌激素可能通过提高nAchR实现其防治AD的作用。
【】
/[1/] 姚芳传.重视老年痴呆的诊断/[J/].实用老年医学,1996,10(3):97.
/[2/] Sohraji F,Miranda R C,Toran?Allerand C D.Estrogen differentially regulats estrogen and nerve growth factor receptor mRNAs in adult sensory neurons/[J/].J Neurosci,1994,14(2):459-471.
［3］HEYS,YAOZB.NGF promotes collateral sprouting fibers in
the septohippocampal transection/[J/].Brain Res,1990,586:27-31.
/[4/] Paxinos G,Watson C.The rat brain in sterro?taxic coordi?nated/[M/].Ed2.Australia:academic press Australia,1988:23-38.
/[5/] Klein R L,Hirko A C,Meyers C A,et al.NGF gene transfer to intrinsic basal fore?brain neurons increases cholinergic cell size and protects from age?related,spatial memory deficits in middle?aged rats/[J/].Brain Research,2000,875:144-151.
/[6/] 郭宗君,金丽英,王洪霞,等.外源性雌激素对IBA和D?gal诱发大鼠认知障碍的干预作用/[J/].老年学杂志,2003,23(11):761-763.
/[7/] Lloyd G K,Williams M.Neuronal nicotlnic acetylcholine receptors as novel drug targets/[J/].J Pharmacol Exp Ther,2000,292:461-467.
/[8/] Fiedler E P,Marks M J,Collins A C.Postnatal development of two nicotinic cholinergic receptors in seven mouse brain regions/[J/].Int J Dev Neurosci,1990,8(3):533-540.
/[9/] Henderson V W.The epidemiology of estrogen replacement theraphy and Alzheimer' s disease/[J/].Neurology,1997,48(Suppl 7):S27-S35.
/[10/] Ute K,Bigl V,Eschrich K,et al.Deafferentation of the septo?hippocampal pathway in rats as a model of the metabolic events in Alzheimer' s disease/[J/].Irit J Devl Neuro?science,2001,19:263-277.
/[11/] Gibbs R B,Wu D H,Hersh L.Pfaff,Effects of etrogen replacement on relative levels of CHAT,TrkA and nerve growth factor messenger RNAs in the basal forebrain and hipp?ocampal formation of adult rats/[J/].Exp Neuol,1994,129(1):70-80.
/[12/] Miller D B,Ali S F,Callaghan O, et al.The impact of genderand estrogen on striatal dopaminergic neurotoxicity/[J/].An nNYAcad Sct,1998,944:153-165.
/[13/] Sohraji F, Miranda R C,Toran?Allerand C D.Estrogen differentiallyregulats estrogen and nerve growth factor receptor mRNAs in adult sensory neurons/[J/].J Neurosci,1994,14(2):459-471.
/[14/] Paganini?Hill A,Henderson V W.Estrogen replacement theraphy and risk of Alzheimer' s disease/[J/].Arch Intem Med,1996,156:2213-2217.
/[15/] Zhang Y,Tounekti O,Akerman B,et al.17?beta?estradiol induces an inhibitor of active caspase/[J/].J Neurosci,2001,21(20):176-180.
