rhTNF?α对TB?LCL趋化作用的研究
作者：闵密克，马超武，徐建中，孙浩，金伯泉
【摘要】 目的 研究重组人TNF?α（recombinant human tumor necrosis factor?α，rhTNF?α）对扁桃体B原淋巴细胞（tonsil B lymphoblastoid cell line，TB?LCL）的趋化作用，建立一个模型以研究细胞因子与B细胞相互间的作用。方法 用 EB病毒（Epstein?Bar virus，EBV）转化扁桃体B细胞建立TB?LCL系，以小室法研究rhTNF?α）对TB?LCL的趋化作用。结果 rhTNF?α对TB?LCL有明显趋化作用，并呈剂量依赖关系。这种作用能为抗TNF?α的单抗E6所阻断。结论 以上为研究细胞与细胞因子间的相互作用提供了有用而简便的模型。
【关键词】 重组人TNF?α； 扁桃体B原淋巴细胞；趋化
Abstract： Objective To investigated the chemoattractant of rhTNF?α on TB?LCL.Methods LTC were transfected with EBV to get tonsil B lymphoblastic cell line(TB?LCL).Results It was found rhTNF?α can chemoattracts TB?LCL,in a ose?dependnt manner and this chemiotactic effect can be blocked by the neurtralizing antobody E6 against TNF.Conclusion This is a useful model in study the interfere between chemokine and immunocyte.
Key words： recombinant human tumornecrosis factor?α;tonsil B lymphoblastoid cell line;chemoattractant
Corcione等[1]发现TNF?α对人扁桃体初始B细胞以及记忆B细胞有趋化作用，还发现所有扁桃体B细胞均可以合成TNF?α。因此他们认为TNF?α以旁分泌与自分泌的形式参与调节B淋巴细胞在次级淋巴器官中的迁移。为了进一步的研究，需建立一个合适的模型。
1 材料和方法
1．1 材料
可产生国际标准EBV毒株的B95?8细胞由第四军医大学免疫教研室保存。rhTNF?α由第四军医大学生物技术中心惠赠。二甲基亚砜（DMSO）购自FLUKA公司。鼠抗人HLA?DR，CD 19 mAb由第四军医大学免疫教研室制备。趋化小室底膜孔径为8 μm，由日本仓敷纺绩株式会社出品。夹心法ELISA检测TNF?α试剂盒由第四军医大学免疫教研室出品。
1．2 方 法
1．2．1 EBV的制备
复苏B95?8细胞。用含20%FCS的RPMI?1640完全培养基（Sigma公司），在37 ℃，5%CO2的孵箱中培养15 d。离心，2 500 r/min，1 min，上清以0．45 μm 滤器过滤后冻存备用。
1．2．2 腭扁桃体细胞（palatine tonsil cell，PTC）的准备
PTC单细胞悬液以前述方法制备，记数。离心，1 000 r/min，3 min，弃上清。沉淀重悬于冻存液[含10% DMSO的FCS（V/V）]中，1×106/ml。置于-70 ℃ 冰箱，24 h 后移入液氮中。
1．2．3 TB?LCL的制备
复苏冻存的PTC，调整细胞数至5×105/ml。取1 ml 加入10 ml 离心管中，再加入等体积B95?8（EBV高产株）培养上清液，置于37 ℃，5% CO2的孵箱培养。每周加含20%FCS的RPMI?1640 0．5 ml。3周后，移至25 ml 培养瓶中继续培养。4周后，可见增殖迅速、形态似母细胞样并相互聚合成团的TB?LCL，即可扩大培养。
1．2．4 间接免疫荧光染色和流式细胞术分析鉴定TB?LCL
用直头滴管， 轻轻吹打TB?LCL悬液， 直至其成为单细胞悬液，调整细胞浓度至5×106/ml，各取40 μl 细胞悬液，分别加入有HLA?DR，CD19，CD3和SEB单抗的离心管中，再加入1：20灭活的正常山羊血清。4 ℃，静置30 min，洗涤液洗涤2次，1 000 r/min，5 min。弃上清，加入50 μl 1:100稀释的，FITC标记的兔抗鼠IgG F（ab'）2段，摇匀，4 ℃ 静置30 min。洗涤两次后加入200 μl 固定液，流式细胞仪检测TB?LCL上各类分子的表达情况。
1．2．5 rhTNF?α对LCL的趋化作用
将不同浓度的rhTNF?α（比活性106 U/mg）分别加入24孔板，400 μl/孔。调整TB?LCL至1×106/ml，取200 μl 加入趋化小室。将小室置于24孔板中，37 ℃，5% CO2孵育。实验终止时在24孔板中加入EDTA，终浓度为5 mmol，继续孵育15 min。人工记数24孔板中的TB?LCL浓度。
1．2．6 夹心ELISA法检测小室内外rhTNF?α浓度的变化
留取不同时间点小室内和24孔板中溶液样品，用夹心法ELISA检测TNF?α试剂盒检测rhTNF?α浓度的变化。将包被抗体用包被缓冲液1：100稀释后，加入ELISA板，100 μl/孔，4 ℃ 过夜。洗涤液冲洗 ELISA板3次，加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品，100 μl /孔，37 ℃，1 h。洗板3次，加1：100稀释的酶标抗体，100 μl/孔，37 ℃ ，1 h。洗板 3次，加入显色液100 μl/孔，37 ℃，显色15 min。ELISA读数仪测410 nm 处OD值，绘制标准曲线，rhTNF?α的浓度。
1．2．7 抗TNF?α的单抗E6对TNF?α对TB?LCL趋化的抑制作用
在24孔板中加入10 μg/L rhTNF?α。分别加入不同浓度的具有中和活性的抗TNF?α的单抗E6，自1 μg/L 到1 000 μg/L，37 ℃，预先孵育15 min。其余步骤同前。分别计数TB?LCL自发游走的数，最大趋化数，及加了抗体后的趋化数，计算逆转率V＝（最大趋化数-加了抗体后的趋化数）/（最大趋化数-自发游走的数）。第1期rhTNF?α对TB?LCL趋化作用的研究 闵密克，等
2 结 果
2．1 TB?LCL的转化成功和表型鉴定
与EBV共同培养2周后即可见有少量形态多样，聚集成团的细胞出现。由于此时系统中仍有CTL，转化的细胞增长缓慢。到第四周时，CTL全部死亡后，LCL的数量迅速增加。流式细胞术（flow cytometry，FCM）鉴定表明TB?LCL为CD19+，CD3-，且HLA?D类分子表达增加，如图1。
2．2 rhTNF?α趋化TB?LCL的浓度依赖性
TB?LCL对rhTNF?α的趋化反应呈浓度依赖。在10 μg/L 达到最大，如图2。在不含rhTNF?α的阴性对照孔，仍有TB?LCL渗出于小室外。为了证实这部分细胞不是自小室底膜“漏”出的，我们预先将TB?LCL用4%多聚甲醛固定后再进行趋化实验。发现阴性对照中不再有渗出的细胞。可见这是一种细胞无定向的、自发的、无规则运动。
2．3 rhTNF?α趋化TB?LCL的动态变化
根据细胞种类的不同，采用的趋化作用时间长短不等，最短为1h，最长可至5 h。本研究以5 h 末自小室趋化出的细胞数为100%，不同时间点趋化出的细胞的百分率。2 h 即有57．7%，3 h 已达到92．3%（图3）。
2．4 小室内外rhTNFα浓度变化趋势
趋化开始时小室内液面高于小室外，大约40 min 后，两液面持平（图4）。此时小室外的rhTNF?α开始向小室内扩散。随着时间的推移，小室内rhTNF?α的浓度逐渐增加，小室外浓度缓慢下降。到第5 h 末，小室内外仍存在浓度差。
2．5 抗TNFα的单抗E6对趋化的阻断
为了证实TB?LCL的趋化现象是由rhTNF?α引起的，我们将不同浓度E6与10 μg/L TNF?α预先孵育，然后再进行趋化实验，同时以无关抗体SEB设立相应的对照组。在抗体浓度为1 000 μg/L时，E6对10 μg/L TNF?α趋化的逆转率可达53．8%（图5）。
3 讨论
EBV通过与 B细胞表面的受体CD21结合而感染 B细胞，使其母细胞转化成为LCL。LCL虽然形态上呈现多样性（梭形、椭圆形、梨形等等），而且已经永生化，可以无限分裂增殖，并表达许多B细胞活化抗原和黏附分子，但是其B细胞的基本性质及遗传特征并未改变，因此可以用此法保存某些具有特定生物学性状的标本。基于以上原因，EBV转化B细胞是一种常用的，简便有效的建立细胞系的方法。目前建立LCL一般采用环孢素A（CysA）法，此方法操作复杂，成功率在40%~60%之间。原因是B细胞被EBV转化后会遭到CTL的攻击。一方面转化后的B细胞不断增殖，另一方面培养中的CTL分化为效应CTL，并不断杀灭LCL。双方斗争一直持续3周左右。当培养中的CTL全部死亡时，LCL迅速增殖，即转化成功。CysA通过抑制CTL，可提高转化率。曾有研究表明，用EBV转化扁桃体细胞难度较大，因为扁桃体中EBV特异性CTL的细胞毒活性高[2]，本研究将冻存细胞法[3]和微量细胞法相结合制备LCL，取得了满意的转化率(11/11)。可能因为采用这一方法后，转化系统中细胞总数少，CTL的数量相应减少，同时冻存?复苏的过程影响了CTL的活性抑或使B细胞对EBV的敏感性增加，故而转化率提高。本研究以EBV转化的扁桃体B原淋巴细胞（TB?LCL）作为研究对象。与组织细胞或其他已建系的细胞相比LCL有很多独特之处，例如表达许多黏附分子，容易聚集成团，这影响了最终实验结果的评定。本实验根据这个特点，相应在方法学上进行了一些改动。常规趋化实验结果评价的方法是在实验结束时将小室底部的膜揭下，经固定、染色后显微镜下随机记数5个高倍视野中的细胞数[4]。由于TB?LCL通过小室膜后，大多数自膜上脱落，只有极少量仍黏附于膜上。并且TB?LCL有黏附成团的倾向，不能均匀地分布于膜上，因此随机选取视野难以代表整体情况。本研究将评价结果的方法稍作改动。在实验结束时加入EDTA，终浓度为5 mmol，孵育15 min，使得黏附于小室膜底面上的细胞脱落下来，然后通过仔细记数24孔板中TB?LCL浓度反映TNF?α趋化TB?LCL的程度。本实验证明了rhTNF?α对TB?LCL有趋化作用。首先rhTNF?α对TB?LCL的趋化作用是浓度依赖的。在rhTNF?α浓度为10~100 μg/L 时，趋化出小室的细胞最多。其次趋化呈的动态变化，游走出的细胞在0~3 h 增加最迅速，3 h 以后，趋化运动接近停滞。存在趋化剂的浓度梯度是趋化的必要条件。通过ELISA检测可知，在整个趋化过程中，小室内外始终存在浓度梯度。最后，rhTNF?α对TB?LCL的这种趋化作用可被具有中和活性的抗TNF?α的单抗E6阻断，而无关抗体SEB则没有阻断作用，证明这种趋化作用是由rhTNF?α引起的。具体rhTNF?α是作用于TNFR?Ⅱ（与未转化的扁桃体B细胞相同）还是TNFR?Ⅰ，有待下一步实验证实。1975年Carswell等发现接种卡介苗的小鼠注射LPS后，血清中含有一种能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生出血坏死的因子，遂称之为肿瘤坏死因子（TNF）。以后将巨噬细胞产生的这种细胞因子叫TNF?α，由T淋巴细胞产生的叫淋巴毒素（lymphotoxin，LT），又叫 TNFβ[5]。LT/TNF家族由同源三聚体TNF3，LT?α3和异源三聚体LT?α1 β2组成。前两者的受体是TNFR?Ⅰ，TNFR?Ⅱ，LT?α1 β2的受体是 LT?βR。虽然人们最先发现的是LT/TNF抗肿瘤的作用，但目前所知LT/TNF的主要作用是参与外周淋巴器官的形成及调节各种急、慢性炎症[6~8]。淋巴器官形成与炎症反应看似两个不相关的过程。事实上却有很多相同之处。当炎症（不论是由感染引起的还是自身免疫性疾病引起的）转为慢性时，可以将其看作是在局部形成了一个“三级淋巴器官”。转基因小鼠和基因敲除小鼠都证明LT/TNF在淋巴器官形成和炎症反应中发挥了关键作用[9]。LT/NF作为促炎因子，不但出现在炎症的早期，而且几乎参与了炎症反应的每一步。造血源性的细胞，如B细胞和巨噬细胞，随血液流动迁移到目的地，产生TNF作用于固定的组织细胞上的TNFR，使其产生一系列的效应，如分泌BLC，MCP?1和MIP?1α等趋化因子[10]，表达 ELAM，VCAM，ICAM，MAdCM，PNAd等黏附分子［11］，招致免疫细胞参加淋巴器官形成或炎症反应。通常条件下TNF?α作为重要的促炎因子，启动炎症反应，发挥保护机体的作用。在另一些情况下TNF?α也会造成病理损害。慢性丙型肝炎患者的TNF/TNFR?Ⅱ水平与巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulatingfactor，M?CSF）的分泌水平相关，参与肝脏纤维化的过程［12］。再比如，局部慢性炎症与皮肤癌有直接的关系，因为慢性炎症导致细胞细胞超常，进而发生癌变。TPA（12?0?tetradecanoylphorbol?13?acetate，TPA）对TNF?α小鼠的致癌作用只有野生型小鼠的5%~10%［13］。TNF?α有两种受体：TNFR?Ⅰ和 TNFR?Ⅱ。其中 TNFR?Ⅰ与淋巴器官的发育关系密切。TNFR?Ⅰ缺陷的小鼠生发中心（GC）形成障碍，TNFR?Ⅱ缺陷则不伴有此现象。TNFR?Ⅱ的作用尚不清楚。扁桃体初始B细胞和记忆B细胞两种受体均表达。但是TNF?α对扁桃体B细胞的趋化作用只选择性地作用于TNFR?Ⅱ。TNF?α不能趋化的生发中心B细胞是因为它两种受体均不表达。但是扁桃体B细胞不论是初始化的B细胞还是记忆B细胞或是生发中心B细胞均产生TNF?α。TNF?α的这种组成性表达可能是因为TNF?α参与调节淋巴细胞在组织中的迁移。初始B细胞尚未接受抗原刺激，记忆B细胞为已接触抗原，并可能是曾发生过活化和增殖后的B细胞。TNF?α趋化初始B细胞和记忆B细胞，不趋化生发中心B细胞，因为募集初始B细胞可以启动新的免疫反应，募集记忆B细胞可以引起回忆反应。生发中心B细胞正处于分化中，尚不能发挥功能，因此不表达TNFR，对TNF?α无反应。机体通过调节TNFR的表达调节需要趋化的细胞。目前人们对淋巴细胞定向归巢的机制和过程了解较多，相对而言对淋巴细胞进入组织以后的再分布、定位以及离开组织重新进入循环等过程知之甚少。也许TNF?α的这种组成性表达与这些过程有关。
【】
/[1/] Corcione A, Ottonello L, Tortolina G,et al. Recombinam tumor necrosis factor enhances the locomotion of memory and naive B lymphocytes from human tonsils through the selective engagement of the type Ⅱ receptor/[J/]. Blood,1997,90:4493-4501.
/[2/] Hirao M, Harabuchi Y.Analysis of Epstein?Bar virus?specific cellular cytotoxicity in tonsilla lymphocytes/[J/].Nippon Jibiinkoka Gakkai Kaiho,1994,97(3):473-484.
/[3/] 刘 敏,吴雄文,吴 锋,等.简单可行的EB病毒转化B淋巴细胞方法的探讨/[J/].同济医科大学学报,1997,26:274-278.
/[4/] Zigmond S H,Hirsch J G.Leukocyte locomotion and chemotaxis.New methods for evaluation,and demonstration of a cell?derived chemotactic factor/[J/].J Exp Med,1973,137(2):387-410.
/[5/] 金伯泉.细胞与分子免疫学/[M/].北京:世界图书出版公司,1995:129-133.
/[6/] Ruddle N H.Lymphoid neo?organogenesis:lymphotoxin's role in inflammation and development/[J/].Immunol Res,1999,19(2-3):199-125.
/[7/] Rennert P D,James D,Mackay F et al.Lymph node genesis is induced by signaling through the lymphotoxin beta receptor/[J/].Immunity,1998,9(1):71-79.
/[8/] Czermak B J,Sarma V,Bless N M,et al.In vitro and in vivo dependency of chemokine generation on C5a and TNF?alpha/[J/].J Immunol,1999,162(4):2321-2325.
/[9/] Ngo V N,Korner H,Gunn M D,et al.Lymphotoxin alpha/beta and tumor necrosis factor are reqiured for stromal cell expression of homing chemokines in B and T cell areas of the spleen/[J/].J Exp Med,1999,189(2):403-412.
/[10/] Sedgwick J D,Riminton D S,Cyster J G,et al.Tumor necrosis factor:a master?regulator of leukocyte movement/[J/].Immunol Today,2000,21(3):110-113.
/[11/] Ruddle N H,Lymphoid neo?organogenesis:lymphotoxin's role in inflammation and development/[J/].Immunol Res,1999,19(2-3):119-125.
/[12/] Itoh Y,Okanoue T,Ohnishi N,et al.Seum lerels of soluble tumor necrosis factor receptors and effects of interferon therapy in patients with chronic hepatitis C virus infection/[J/].Am J Gastroenterol,1999,94(5):1332-1340.
/[13/] Moore R J,Owens D M,Stamp G,et al.Mice deficient in tumor necrosis factor?alpha are resistant to skin carcinogenesis/[J/].Nat Med,1999,5(7):828-831.
