TNF?α在沙漠干热环境下猪腹部肠管火器伤后肝组织中的表达
作者：刘江伟 张永久 李泽信 吕月涛 张东 雷涛 冯德元
【摘要】 目的 探讨沙漠干热环境下猪腹部肠管火器伤后肝脏组织TNF?α的表达和肝功能的变化。方法 沙漠干热环境组和常温环境组健康长白仔猪各42头随机等分为对照组和伤后1、2、4、8、12 h 和24 h 组，实验组建立腹部火器伤肠管穿透模型后，用免疫组化及图像分析法测定各组肝脏组织内TNF?α的表达，同时测定血清中AST水平。结果 伤后各组肝组织TNF?α表达明显高于对照组，沙漠干热环境组于伤后2 h 和8 h 出现2个高峰；常温环境组于伤后2 h 和12 h 出现2个高峰。血清AST水平于伤后显著增高，并于伤后2 h 出现第1个高峰，沙漠干热环境组和常温环境组分别于伤后8 h 和12 h 出现第2个高峰。结论 沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后肝脏TNF?α的表达增加并与AST的变化趋势一致，而且峰值较常温组提前出现，提示TNF?α在腹部肠管火器伤后肝损伤过程中可能起重要作用。
【关键词】 腹部火器伤；肝损伤；干热环境；沙漠；肿瘤坏死因子－α
Abstract： Objective To investigate the expression of tumor necrosis factor (TNF)?α in hepatic tissue and the change in hepatic function in pig with intestinal perforation due to abdominal firearm wound in dry?heat environment of desert. Methods A total of 84 Changbai piglets were divided equally into normal temperature environment group and dry?heat desert environment group. Each group was equally divided into seven sub?groups randomly: control group and wounded 1?hour group, 2?hour group, 4?hour group, 8?hour group, 12?hour group, and 24?hour group. The model of intestinal perforation due to abdominal firearm wound was established in the wounded groups. Expression of TNF?α was measured with immunohistochemistry and image analysis in all the groups. Serum AST level was also determined at the same time. Results The expression of hepatic TNF?α in the wounded groups were significantly elevated when compared with the control groups. It appeared to reach two peaks in 2?hour group and 8?hour group in the dry?heat desert environment group, and another two peaks in 2?hour group and 12?hour group in the normal temperature environment group. Levels of serum AST in the wounded groups were significantly elevated when compared with the control groups. The dry?heat desert environment group appeared to have two AST peaks at 2?hour group and 8?hour group, and the normal temperature group appeared to have two AST peaks at 2?hour group and 12?hour group. Conclusion The expression of TNF?α in hepatic tissue in pigs with intestinal perforation due to abdominal firearm wound in dry?heat desert environment is significantly elevated and accompanied with damage of hepatic function. The peaks of TNF?α and AST appear earlier in dry?heat desert environment than in normal temperature environment, which suggested that TNF?α may play an important role in liver injury of pigs with intestinal perforation due to abdominal firearm wound in dry?heat environment of desert.
Key words： abdominal firearm wound; liver injury; dry?heat environment; desert; tumor necrosis factor?α
肿瘤坏死因子?α（TNF?α）是具有广泛生物学活性的多肽介质，介导了多种原因（如LPS等）引起的肝损伤[1]。本实验以猪腹部火器伤肠管穿透模型为基础[2~3]，探讨沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后TNF?α在肝脏组织中的表达及肝脏功能的变化，为沙漠干热环境下腹部火器创伤机制的研究和救治奠定基础。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及环境
选用健康长白仔猪84头（解放军63650部队提供），2~3月龄，体重27~33 kg，雌雄不限，随机分为沙漠干热组和常温组，每组均为42头，每组又随机等分为对照组、伤后1、2、4、8、12 h 和24 h 组7个亚组。沙漠干热环境组实验场地位于新疆塔克拉玛干沙漠边缘，时间在2006年7月下旬到8月初，实验从中午12：00开始，沙漠干热环境组实验动物在沙漠干热环境下预热 3 h 后致伤，平均气温（41.2±0.9）℃，平均相对湿度（22.3±1.3）%，辐射热强度＞4.184 J/cm2·min；常温组实验动物在常温环境下致伤，常温及实验室环境：平均温度（23.7±0.4）℃，平均相对湿度（55.6±1.4）%。沙漠干热环境组和常温组动物在致伤后15min内转移到实验室进行观察。
1.2 腹部火器伤模型
参照[2]的方法建立腹部肠管火器伤模型。实验组于伤后相应时间点麻醉开腹，每组动物均取肝左中叶下段肝组织，10%甲醇固定，常规石蜡切片。沙漠干热组和常温组中的对照组除不致伤外，其余步骤与致伤组相同。
1.3 血清肝生化测定
实验各组分别于伤后各时间点剖腹前抽取猪耳缘静脉血，对照组回实验室后立即抽血，东芝全自动生化分析仪(TBA?40FR)测血清中AST水平。
1.4 免疫组化图像分析法检测TNF?α的表达
按TNF?α免疫组化试剂盒（购自博士德公司）使用按说明操作。参照文献[4]所介绍的方法用Image?pro Plus5.0医学图像分析软件检测阳性染色部位的累积光密度值，用来表示TNF?α表达相对量。每张切片随机选取5个不重叠的高倍镜视野分析，分析过程中所有切片的放大倍数（×400）、光源强度均相同。
1.5 统计学方法
实验数据以±s表示，应用 SPSS11.0统计软件进行统计学分析，采用One?Way ANOVA过程进行成组设计的方差分析。
2 结果
2.1 动物存活情况
常温组中伤后1、2、4、12 h 组动物全部存活，伤后8、24 h 组各死亡1头；干热组中2、4、8、24 h 组各死亡1头，12 h 组死亡2头。表1 肝脏TNF?α 表达灰度和血清AST的变化(略)
2.2 肝组织TNF?α的表达
TNF?α染色阳性呈黄色或棕黄色颗粒，以肝细胞和库普弗细胞为主，并间质着色，其阳性表达强度于伤后明显增强。 用医学图像分析系统检测各组肝内TNF?α 表达的变化， 伤后各组TNF?α表达均明显高于对照组(P＜0.01)， 除12 h 组外，沙漠干热环境组TNF?α的表达在相对时间点均高于常温环境组，其中4、8、24 h 组差异具有显著统计学意义(P＜0.01)， 两环境组均在2 h 出出现第1个高峰值，干热环境组第2个高峰值出现在8 h，常温环境组第2个高峰值出现在第12 h。伤后各时间组与前一时间组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
2.3 血清AST的变化
沙漠干热环境实验组和常温环境实验组伤后血清AST水平均高于对照组(P＜0.01)，干热环境实验组于伤后2 h 和8 h 出现2个高峰。常温环境实验组于伤后2 h 和12 h 出现2个高峰。在4、8、24 h 组中沙漠环境AST明显高于常温组 (P＜0.01)，但在12 h 沙漠干热组AST低于常温组AST(P＜0.01)。伤后各时间组与前一时间组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
3 讨论
腹部火器伤后由于枪伤应激、火器伤的远达效应、化学性腹膜炎、肠穿孔周围肠壁挫裂震荡和烧灼坏死以及肠屏障受损可能易造成内毒素（LPS）血症、细菌移位和大量炎症因子入血，从而导致脓毒症、脓毒性休克、MODS等而致死[5]，肿瘤坏死因子被认为是一种重要而又关键的介质[6~7]。本实验以腹部火器伤肠穿孔模型来观察伤后肝内TNF?α的变化并探讨其在肝损伤中的作用，为腹部火器伤后继发性肝损伤和MODS的防治提供实验依据。
本研究发现，伤后各组TNF?α表达均明显高于对照组，沙漠干热环境组于伤后2 h 和8 h 出现2个高峰；常温环境组于伤后2 h 和12 h 出现2个高峰。伤后各组TNF?α表达均明显高于对照组，沙漠干热环境组中除12 h 组外，TNF?α的表达在相对时间点均高于常温环境组，其中4、8、24 h 组差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。在常温环境和沙漠干热环境下腹部火器伤肠管穿透后猪血清AST迅速增高，两环境组均于伤后2 h 达到第1个高峰值，沙漠干热组AST的第2个高峰值出现在8 h，而常温组出现在12 h。在4、8、24 h 三个时间点，沙漠干热环境AST明显高于常温组(P＜0.01)。但在12 h，沙漠干热组AST低于常温组AST(P＜0.01)。表明腹部肠管火器伤后，TNF?α的表达明显增加并呈动态变化，其变化趋势和肝脏功能受损状态一致，提示TNF?α可能在火器后介导肝脏功能损害过程中起重要作用。腹部火器伤后由于枪伤应激、肠屏障受损以及子弹的远达效应导致了肝脏的急性损伤，使TNF?α的表达和AST分别在1 h 和2 h 时迅速达第1个高峰；第2个峰值产生的原因可能是在原来急性创伤的基础上由于肠穿孔所致腹腔感染导致了脓毒症，大量LPS经门静脉入血，从而使TNF?α的表达增加，并肝功能受损明显。除12 h 组外，沙漠干热环境组TNF?α表达和AST均较常温环境组提高，而且峰值提前出现，可能是由于在高热环境的热应激状态下，细菌繁殖和生长加快，更加速了脓毒症的发生和LPS的入血。LPS可直接或通过炎性因子的作用引起肝细胞的坏死[6]，在12 h 沙漠干热环境组TNF?α表达和AST均较常温环境组降低，可能在热应激状态下尚存在一些肝脏保护方面的因子与肝脏损害因子相互作用的结果，其机制尚待进一步研究。由于肝损伤机制的复杂性使TNF?α表达和AST在伤后24 h 内有波动，但二者的变化趋势基本一致。
总之，沙漠干热环境下腹部肠管火器伤后肝脏TNF?α的表达增加并与AST的变化趋势一致，而且峰值较常温组提前出现，提示TNF?α在腹部肠管火器伤后肝损伤过程中可能起重要作用。而沙漠干热环境腹部火器伤肠管穿透后继发性肝损伤的发生机制有待进一步研究。（感谢解放军63650部队卫生处及解放军546的大力协作）
【】
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